醬油釀造中米曲霉和醬油曲霉復合制曲的研究

李荔，童星

(佛山市海天調味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000)

制曲是我國釀造工業(yè)的一項傳統(tǒng)技術，廣泛應用于多類傳統(tǒng)發(fā)酵食品(醬油、醬類、豆豉、腐乳等) 的生產。制曲的實質是創(chuàng)造微生物生長的最適條件促進蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等的分泌從而將原料中的蛋白質、淀粉、纖維素水解產生氨基酸、多肽、葡萄糖等復雜的風味物質。在醬油生產過程中，米曲霉和醬油曲霉是常用的菌株，對醬油生產的原料利用率和醬油的風味起著決定性的作用[1]。我國自1957年全國醬油試點確定選用米曲霉3.863以后, 全國各地紛紛采用米曲霉及其變異株來生產醬油。米曲霉3.042是上海釀造實驗工廠對原種AS3.863通過人工誘變得到的1株優(yōu)良醬油釀造用菌株, 現(xiàn)已在全國普遍使用[2]。日本學者于20世紀30年代從醬曲中分離得到可產生大量堿性蛋白酶和高谷氨酰胺酶特性的醬油曲霉，并受到廣泛重視，是日本醬油釀造的主要菌種之一[3,4]。我國因偏重米曲霉的應用，目前對醬油曲霉的關注不多。

近年來，不少學者提出了多菌種應用提高制曲質量的設想。李琴等[5]研究了米曲霉和黑曲霉混合制曲提高醬油釀造原料的利用率和風味。王素珍等[6]通過米曲霉與增香曲的復合應用，提高了醬油的紅黃指數和改善了烹飪效果，均取得了一定的進展。目前關于米曲霉和醬油曲霉復合制曲的研究報道較少，本文通過分析米曲霉和醬油曲霉雙菌混合制曲對酶系的分泌及發(fā)酵指標風味的影響，以期為醬油現(xiàn)代生產技術的提升提供理論基礎，解決單一菌株制曲存在的風味不足問題。

1 材料與方法

1.1 材料

AS3.042(Aspergillusoryzae)和HT.AS125(Aspergillussojae)來自保藏菌株；大豆、面粉均為市售：其他試劑均為分析純。

KDN-04A 定氮儀 上海昕瑞儀器儀表有限公司；722 微機型可見分光光度計 上海精密儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；PB-10 sartorius pH計 德國賽多利斯集團；FA/JA 系列電子天平 上海上平儀器公司；Leu-Gly-Gly 上海西寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制曲方法

以重量百分比計，取70%黃豆，1.2 倍潤水，用高壓蒸汽滅菌鍋115 ℃蒸料15 min。熟料快速冷卻至37～40 ℃，拌入30%的面粉，按原料重量接入0.15%(m/m)曲霉菌種，拌勻。按照通風制曲培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，溫度控制在30～35 ℃，制曲時間42 h。

1.2.2 混合制曲菌種復合方法

將AS3.042和HT.AS125曲種烘干磨碎按照重量比1∶0,6∶1,4∶1,2∶1,1∶1,0∶1進行混合拌料菌種，按照1.2.1的方法進行制曲。

1.2.3 發(fā)酵方法

采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵法，30 ℃發(fā)酵60天，對發(fā)酵醪汁過濾取濾液進行分析。

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 粗酶液提取

稱取5 g成曲，研磨后加入60 mL蒸餾水，40 ℃浸提1 h，每間隔20 min攪拌1次。根據不同酶活測定所需的緩沖液分別定容到合適的濃度，中速定性濾紙過濾即為粗酶液。同時測定曲料水分，酶活力統(tǒng)一用曲料干基重量表示，即U/g。

1.2.4.2 中性蛋白酶活力測定

參照國標GB/T 23527-2009[7]，采用福林法測定中性條件下pH值為7.2的蛋白酶活力，酶活定義：在40 ℃每1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需酶量，定義為1個蛋白酶活力單位。

1.2.4.3 氨肽酶活力測定

以L-亮氨酸-對硝基苯胺為底物，在40 ℃，pH值為8.0條件下，每1 min水解生成1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為1個酶活力單位[8]。

1.2.4.4 谷氨酰胺酶活力測定[9]

在40 ℃，pH值為7.2的條件下，每1 g醬油曲中的谷氨酰胺酶每1 min催化L-谷氨酰胺分解生成1 μmol L-谷氨酸，即為1個酶活力單位，以U/g表示。

1.2.4.5 α-淀粉酶的測定

采用DNS試劑法[10]，以50 ℃，pH 4.8，每1 min水解淀粉生成1 μg葡萄糖為1個酶活力單位(U)。

1.2.4.6 理化指標的檢測

全氮測定參照《食品中蛋白質的測定》方法(GB/T 5009.5-2003)；氨基酸態(tài)氮和總酸采用電位滴定儀方法(GB/T 5009.39-2003)；還原糖測定參照《食品中還原糖的測定》方法(GB/T 5009.7-2008)。

1.2.4.7 氨基酸生成率

氨基酸生成率(%)=醬油中氨基酸態(tài)氮含量/醬油中全氮含量×100%。

1.2.5 數據整理和分析

所有的試驗均進行3次平行取平均值，采用SPSS 11.5和Origin 6.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 AS3.042和HT.AS125酶系的差異

按照上述方法對比分析了AS3.042和HT.AS125單獨制曲產酶的差異，結果見圖1。

圖1 AS3.042和HT.AS125制曲酶系對比

由圖1可知,AS3.042的中性蛋白酶和α-淀粉酶活力較高；HT.AS125的谷氨酰胺酶和氨肽酶活力較高，中性蛋白酶低。說明兩類菌株的產酶特性存在顯著的差異，這與菌株自身的特性有一定的關系。較高的谷氨酰胺酶和氨肽酶活力是HT.AS125菌株的重要特性，這為雙菌株的復合制曲提供了可能。

2.2 不同菌種復配比例對制曲質量的影響

AS3.042和HT.AS125按照菌種比例1∶0，6∶1，4∶1，2∶1，1∶1和0∶1進行混合制曲，從成曲的酶系、pH值等幾個角度分析2種曲霉混合制曲對制曲質量的影響，結果見圖2和表1。

圖2 AS3.042和HT.AS125不同比例復合制曲酶系對比

AS3.042∶HT.AS125pH水分(%)成曲感官1∶06.1428.1曲料生長均勻,外觀黃綠色,具有特有的曲香味,無氨味和酸味6∶16.4627.9曲料生長均勻,外觀黃綠色,具有特有的曲香味,無氨味和酸味4∶16.4728.8曲料生長均勻,外觀黃綠色,具有特有的曲香味,略帶蘑菇香2∶16.7428.7曲料生長均勻,孢子略少,具有特有的曲香味,帶有蘑菇香1∶16.7528.5曲料生長均勻,色澤偏暗,孢子較少,具有特有的曲香味和蘑菇香0∶16.9828.7曲料生長均勻,色澤偏暗,產孢少,具有特有的蘑菇香氣味

從2種菌株復合后曲料的指標來看，米曲霉中添加一定比例的醬油曲霉，隨著醬油曲霉的增多，曲料的中性蛋白酶和淀粉酶呈現(xiàn)下降的趨勢，而曲料的谷氨酰胺酶、氨肽酶、pH呈現(xiàn)遞增的趨勢，雙菌復合制曲成曲的指標介于米曲霉和醬油曲霉單獨制曲之間，說明2種菌株在制曲過程中分別發(fā)揮了自己的特點。但從變化規(guī)律來看，各指標無明顯的線性規(guī)律，這主要與2種菌株之間的相互競爭協(xié)同作用有一定的關系。對比成曲的感官，AS3.042和HT.AS125按照6∶1復合時曲料的香氣和感官與AS3.042單獨培養(yǎng)比較接近；按照2∶1復合時曲料的感官的孢子生長和香氣已經有明顯的改變，說明醬油曲霉HT.AS125在混合菌株中已發(fā)揮較大的作用。

2.3 不同比例菌株復合發(fā)酵結果分析

根據制曲結果分析，2個菌株復合后在蛋白酶和氨肽酶、谷氨酰胺酶方面存在顯著性差異，因此以氨基氮、全氮、谷氨酸、氨基酸/全氮等指標作為菌種復合比例確定的依據，結果見表2。

表2 不同比例菌株復合對發(fā)酵質量的影響

從發(fā)酵結果可以看出，米曲霉與醬油曲霉雙菌種制曲后還原糖和全氮有一定的下降，這與醬油曲霉的蛋白酶和淀粉酶活力較低有直接的關系，但氨基氮和谷氨酸均有不同程度的提升。結合發(fā)酵油的感官鑒評結果，AS3.042和HT.AS125按照4∶1的比例復合，醬油的滋味有明顯的改善，表現(xiàn)為鮮甜較好，口感協(xié)調，同時醬油的醬香較好，保留了原始產品的特征。AS3.042和HT.AS125按照1∶1的比例進行復合，醬油的氨基氮/全氮和谷氨酸生成率均有明顯的提升，醬油具有鮮味突出的特點，但由于在香氣方面已改變了原有菌株的特色，同時全氮較低，不適合在生產中應用。綜合考慮，AS3.042和HT.AS125按照4∶1復合作為最佳的配比，氨基氮生成率提高5.37%，谷氨酸生成提高25.41%，釀造醬油的風味得到明顯改善。

2.4 不同制曲溫度對AS3.042和HT.AS125復合制曲產酶的影響

制曲過程分為曲霉的菌絲生長期和產酶期，制曲溫度是影響曲霉生長和產酶最重要的因素之一。為研究混合制曲最佳的產酶溫度，菌種比例按照AS3.042∶HT.AS125為4∶1混合，在第1次松曲以后，設置了26，28，30，32，34 ℃進行培養(yǎng)，分析谷氨酰胺酶生成能力，結果見圖3。

圖3 不同培養(yǎng)溫度下谷氨酰胺酶的生成情況

谷氨酰胺酶的生成主要集中在12～36 h，與培養(yǎng)溫度有較大關系。在12～20 h期間，培養(yǎng)溫度越高，谷氨酰胺酶的生成速率越快；20 h以后，26～30℃的溫度更加有利于谷氨酰胺酶的分泌，最適合的溫度為28 ℃，谷氨酰胺酶活力達到4.65 U/g。32 ℃時谷氨酰胺酶的分泌呈現(xiàn)下降趨勢，34 ℃時谷氨酰胺酶活力最低，說明在制曲過程中谷氨酰胺酶的生成適合偏低溫的環(huán)境。

3 結論

本文通過研究米曲霉與醬油曲霉雙菌復合制曲，取得了以下結果：

米曲霉AS3.042和HT.AS125在酶的分泌上具有互補的特點，米曲霉AS3.042中性蛋白酶和淀粉酶活力較高，HT.AS125谷氨酰胺酶和氨肽酶活力較高，其中HT.AS125是AS3.042的1.48倍。

確定了AS3.042和HT.AS125菌種復合制曲的最佳比例為4∶1，氨基氮生成率提高5.37%，谷氨酸生成率提高25.41%。

確定了AS3.042和HT.AS125菌種復合制曲最適合生成谷氨酰胺酶的制曲溫度是28 ℃，谷氨酰胺酶活力達到4.65 U/g。

結果表明：米曲霉與醬油曲霉混合制曲對于改善醬油風味有較好的應用效果，與米曲霉與黑曲霉復合制曲相比，解決了黑曲霉制曲過程中黑色孢子的環(huán)境污染問題，有良好的應用前景。下一步可繼續(xù)研究米曲霉與醬油曲霉混合制曲過程中的協(xié)同作用機理和競爭抑制關系，為工業(yè)化應用奠定基礎。

參考文獻：

[1]包啟安.醬油科學與釀造技術[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2011.

[2]胡學智,凌晨,李平作.醬油曲霉蛋白酶及其用于醬油釀造的研究[J].江蘇調味副食品,2007,107(5):1-3.

[3]曹駿生.米曲霉和醬油曲霉制造醬油曲和醬油的比較分析[J].中國調味品,1991(2):32-33.

[4]張智文,李長田.傳統(tǒng)腌制調味食品中真菌的概述[J].菌物研究,2013,11(1):57-62.

[5]李琴,杜風剛.雙菌種制曲在醬油生產中的應用[J].中國調味品,2003(12):36-38.

[6]王素珍,劉文鵬,陶貴明，等.雙菌種聯(lián)合發(fā)酵釀制醬油應用研究[J].中國調味品,2009,34(4):55-57.

[7]GB/T 23527-2009,酶制劑[S]

[8]Nampoothiri K M,Nagy V,Kovacs K,et al.L-leucine amino peptidase production by filamentousAspergillusfungi[J].Letters in Applied Microbiology,2005,41(6):498-504.

[9]鄒敏娟.醬油曲中谷氨酰胺酶酶活測定條件優(yōu)化[J].食品與機械,2013,23(3):89-93.

[10]Chutmanop J,Chuichulcherm S,Chisti Y P,et al.Protease production byAspergillusoryzaein solid-state fermentation using agroindustrial substrates[J].Journal of Chemistry and Technology Biotechnology,2008,83:1012-1018.