超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜法測(cè)定火鍋底料中5種生物堿的方法改進(jìn)

包永華，王璐璐，劉帆

(1.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用工程系，杭州 310018；2.浙江方圓檢測(cè)集團(tuán)股份有限公司，杭州 310013)

火鍋，古稱(chēng)“古董羹”，是一種頗受我國(guó)人們歡迎的美食。但近年來(lái)，火鍋卻頻頻被曝出一些安全問(wèn)題[1]，少數(shù)不法經(jīng)營(yíng)者為了牟取暴利，在火鍋底料中違法添加罌粟殼(籽)或其粉碎物、浸提物[2]，誘騙食用者中毒成癮, 危害消費(fèi)者健康。針對(duì)此種行為國(guó)家已多次明令禁止，但由于現(xiàn)行業(yè)內(nèi)缺乏快速有效、針對(duì)性強(qiáng)的檢測(cè)方法，使得食品安全執(zhí)法工作存在一定難度。

罌粟殼，俗稱(chēng)“米殼”，為植物罌粟的干燥成熟果殼[3]，含有20多種生物堿，其中以嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可丁等為主要成分[4]。這些生物堿的副作用亦不可低估[5]，長(zhǎng)期食用無(wú)論從身體上還是心理上都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生嚴(yán)重的依賴(lài)性，造成毒物癖，對(duì)自身和社會(huì)都造成了很大的危害。

目前，罌粟殼中生物堿的測(cè)定方法主要有分光光度法[6]、層析法[7]、示波極譜法[8]、氣相色譜法[9]、液相色譜法[10]、液質(zhì)聯(lián)用法[11]和氣質(zhì)聯(lián)用法[12]。但由于火鍋底料中香料物質(zhì)眾多，給微量生物堿的檢出造成了嚴(yán)重干擾[13]。因此有必要建立一種預(yù)處理方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏、定量準(zhǔn)確且快速的方法來(lái)測(cè)定食品中罌粟殼殘留物的含量。本研究以上海市食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)(DB 31/2010-2012)[14]《火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，著重對(duì)生物堿的提取、樣品預(yù)處理過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，確保在能達(dá)到低檢出限要求的同時(shí)，控制回收率在90%～110%以?xún)?nèi)，RSD均小于10%。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：火鍋底料，購(gòu)于杭州世紀(jì)聯(lián)華超市。

試劑：罌粟堿(純度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安譜，o2si公司，濃度10 mg/L；那可丁(純度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安譜，o2si公司，濃度10 mg/L；蒂巴因(純度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安譜，o2si公司，濃度10 mg/L；嗎啡(純度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安譜，o2si公司，濃度50 mg/L；可待因(純度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安譜，o2si公司，濃度50 mg/L；可待因(D3內(nèi)標(biāo))(純度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安譜，o2si公司, 濃度20 mg/L；嗎啡(D3內(nèi)標(biāo))(純度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安譜，o2si公司, 濃度20 mg/L；乙腈，德國(guó)Merck公司，型號(hào)1.00030.4008，含量99.9%，規(guī)格4 L；C18，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，100 g/瓶；PSA，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，100 g/瓶；超純水儀，美國(guó)Millipore公司；濾膜，北京迪馬科技有限公司，13 mm，0.22 μm，100/pk。

1.2 儀器與設(shè)備

1290 Infinity高效液相色譜儀 Agilent Technologies公司；QTRAP 5500 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈+0.1%甲酸水(梯度洗脫)；流速：0.3 mL/min；柱溫: 30 ℃；進(jìn)樣量: 5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：MRM；霧化氣GS1：65.0 psi；輔助加熱氣GS2：65.0 psi；氣簾氣CUR：35.0 psi；輔助氣溫度TEM：500 ℃；噴霧電壓IS：4800 V；入口電壓EP：10.0 V；碰撞池電壓CXP：12.0 V；碰撞氣CAD：Medium。5種生物堿質(zhì)譜條件參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 5種生物堿質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of five alkaloids

注：“*”為定量離子。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因配制成濃度為10 mg/L以及1 mg/L的標(biāo)樣待用。

1.3.4 樣品預(yù)處理

取樣品5 g，加入5 μL，濃度為20 mg/L的內(nèi)標(biāo)，加入10 mL乙腈，充分渦旋后振蕩10 min，12000 r/min離心5 min后提取上清液，分別加入適量C18和PSA吸附凈化粉末，充分渦旋后靜置約3 min，取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)待測(cè)即可。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)樣質(zhì)譜圖

根據(jù)DB 31/2010-2012標(biāo)準(zhǔn)中的要求，那可丁、罌粟堿、蒂巴因定量限為25 μg/kg，可待因和嗎啡定量限為125 μg/kg。因此按照改進(jìn)步驟中的稀釋倍數(shù)，將 1.3.3 中配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液再次稀釋后分別適量加入空白樣的火鍋底料中，使得那可丁、罌粟堿、蒂巴因標(biāo)樣上機(jī)濃度為5 μg/L，可待因和嗎啡上機(jī)濃度為25 μg/L。經(jīng)過(guò)改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法處理后，進(jìn)樣分析。

圖1 那可丁出峰質(zhì)譜圖Fig.1 The mass-spectrogram of narcotine

圖2 罌粟堿出峰質(zhì)譜圖Fig.2 The mass-spectrogram of papaverine

圖3 蒂巴因出峰質(zhì)譜圖Fig.3 The mass-spectrogram of thebaine

圖4 可待因出峰質(zhì)譜圖Fig.4 The mass-spectrogram of codeine

圖5 嗎啡出峰質(zhì)譜圖Fig.5 The mass-spectrogram of morphine

圖6 內(nèi)標(biāo)物出峰質(zhì)譜圖Fig.6 The mass-spectrogram of internal standard

由圖1～圖6可知，那可丁出峰時(shí)間在3.36 min，峰高最大值9.3e5 cps；罌粟堿出峰時(shí)間在3.34 min，峰高最大值1.1e6 cps；蒂巴因出峰時(shí)間在3.30 min，峰高最大值6.7e5 cps；可待因出峰時(shí)間在0.95 min，峰高最大值2.5e5 cps；D3-可待因內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間在0.95 min，峰高最大值5.5e4 cps；嗎啡出峰時(shí)間在0.95 min，峰高最大值1.2e5 cps；D3-嗎啡內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間在0.94 min，峰高最大值2.4e4 cps。由此可見(jiàn)，火鍋湯料中的基質(zhì)對(duì)嗎啡、罌粟堿等生物堿的檢測(cè)并無(wú)干擾，出峰時(shí)間穩(wěn)定，峰形較為明顯。

2.2 回收率試驗(yàn)

取上述陰性樣品，分別加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得那可丁、罌粟堿、蒂巴因、可待因、嗎啡理論上機(jī)濃度分別為5，10，15，20，25 μg/L，按照 1.3.4 樣品預(yù)處理方法進(jìn)行處理，上機(jī)進(jìn)樣分析后，結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 各目標(biāo)物加標(biāo)回收率Table 2 The recovery rates of five alkaloids

經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)表明，該改良版實(shí)驗(yàn)步驟能夠完全保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效可行性，回收率控制在90%～110%。

2.3 精密度試驗(yàn)

取濃度為 5 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣3次，結(jié)果見(jiàn)表 3。

表3 檢測(cè)方法精密度Table 3 Precision of inspection method

由表3可知，那可丁、罌粟堿、蒂巴因、可待因、嗎啡3次相應(yīng)的RSD值在0.19%～1.33%范圍內(nèi)，精密度良好。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

為驗(yàn)證方法的可靠性，從超市購(gòu)買(mǎi)了某品牌火鍋底料，根據(jù)改進(jìn)后的方法進(jìn)行測(cè)定，樣品均未檢出這5種生物堿目標(biāo)物，結(jié)果令人滿(mǎn)意。

3 結(jié)論

優(yōu)化了樣品預(yù)處理過(guò)程。針對(duì)火鍋底料高油脂的特性，采用乙腈作為溶劑直接振蕩離心提取，C18和PSA靜置凈化，可將嗎啡、罌粟堿等生物堿測(cè)定出來(lái)，且經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)證明，該優(yōu)化方法能夠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求的目標(biāo)物檢出限。

檢測(cè)方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，可靠，重現(xiàn)性好。采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜法定量檢測(cè)了火鍋底料中罌粟堿、嗎啡、那可丁、蒂巴因以及可待因5種生物堿成分的含量。罌粟堿、嗎啡、那可丁、蒂巴因以及可待因的回收率控制在95%～105%以?xún)?nèi)，RSD為0.19%～1.33%，該方法可充分適用于火鍋底料以及其他油脂含量較高食品中生物堿的測(cè)定。

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