5-羥色胺誘導(dǎo)冠狀動脈收縮的機(jī)制研究*

王 昊， 鄧春玉， 饒 芳， 鄺素娟， 楊 慧， 劉 林， 吳 琪， 徐勁松△

(1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 江西 南昌 330006; 2廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 廣東省心血管病研究所， 廣東 廣州 510080)

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)作為神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布于松果體和下丘腦,但其亦可作為自體活性物質(zhì)，儲存于腸嗜鉻細(xì)胞顆粒內(nèi)。在刺激因素作用下，5-HT釋放進(jìn)入血液，被血小板攝取和儲存，并可促進(jìn)血小板聚集、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和血管收縮。因此，5-HT可能在動脈粥樣硬化、高血壓和糖尿病等疾病的病理過程中發(fā)揮作用，進(jìn)而促進(jìn)心血管事件的發(fā)生[1]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，5-HT參與誘導(dǎo)許多重要動脈的收縮。如有研究者發(fā)現(xiàn)，5-HT可通過激活三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)-Ca2+信號通路和二酰甘油(diacylglycerol，DAG)-蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)信號通路，誘導(dǎo)胸主動脈收縮[2]，并可以通過激活RhoA/Rho激酶和Src激酶刺激腸系膜動脈收縮[3]。此外，5-HT亦可誘導(dǎo)基底動脈收縮，其機(jī)制可能與線粒體單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)介導(dǎo)過氧化氫生成增加有關(guān)[4]，5-HT還可通過磷脂酶C(phospholipase C，PLC)/Orai1信號通路誘導(dǎo)冠狀動脈收縮[5]，以上研究結(jié)果提示5-HT通過參與多種信號通路誘導(dǎo)血管收縮，且機(jī)制不盡相同，而5-HT誘導(dǎo)冠狀動脈收縮的機(jī)制研究較少，有待進(jìn)一步闡明。

因此，本研究通過給予不同信號通路的抑制劑，觀察5-HT誘導(dǎo)大鼠離體冠狀動脈血管張力的變化，以研究5-HT誘導(dǎo)冠狀動脈收縮的可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF級雄性Wistar成年大鼠，體重300～350 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2016-0041。

2 主要試劑和儀器

5-HT、沙格雷酯(sarpogrelate)、U73122、硝苯地平(nifedipine)、SKF96365，2-氨基乙氧基苯硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)和卡馬拉素(rottlerin)均購自Sigma；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。其中，nifedipine溶于DMSO，其余均溶于水。Krebs-Henseleit (K-H) 溶液(mmol/L)： NaCl 119、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5和D-Glucose 11.1；高鉀K-H溶液(mmol/L)：NaCl 63.7、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 60、KH2PO41.2、CaCl22.5和D-Glucose 11.1，所用溶液配好通混合氣(含95%O2+5% CO2)充分飽和，調(diào)pH約為7.4。

610M型多通道血管張力測定儀(DMT)；Power Lab 8/30生物信號采集處理系統(tǒng)(AD)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)；Stemi DV4型體視顯微鏡(ZEISS)。

3 主要方法

3.1大鼠離體冠狀動脈環(huán)的制備 采用CO2處死大鼠，用膠帶固定在木板上，打開胸腔充分暴露心臟，取下大鼠的心臟。將取出的心臟立即放入4 ℃ 預(yù)冷，經(jīng)混合氣體(95% O2+ 5% CO2)飽和的K-H液中，并將心臟固定在玻璃皿中的硅膠板上。在冰浴條件下顯微操作分離冠狀動脈，小心去除冠脈周圍的心肌組織，盡量避免鉗夾、牽拉冠脈，以防損傷血管平滑肌，從而影響血管張力。將游離的冠狀動脈剪成長度為1.8～2.0 mm的血管環(huán)。將血管環(huán)穿上2根直徑40 μm的不銹鋼絲，并平行固定在張力儀浴槽內(nèi)的2個鉗夾上，1個鉗夾連接到螺旋測微器，用于調(diào)整冠脈的周長，另1個鉗夾連接到內(nèi)置的高靈敏度張力傳感器，觀察和測定血管環(huán)張力的變化。浴槽內(nèi)預(yù)先放置5 mL 37 ℃ 預(yù)溫的K-H液。對于冠狀動脈，設(shè)定并調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力至1.5 mN，平衡60 min，期間每隔15 min換液1次，并使張力維持在1.5 mN。在加入不同藥物后，血管張力信號通過張力傳感器，再經(jīng)數(shù)模轉(zhuǎn)換器輸入計算機(jī)，完成張力記錄。實(shí)驗(yàn)過程中槽內(nèi)溫度控制在(37±0.5) ℃，并往槽內(nèi)持續(xù)通入95% O2和5% CO2的混合氣體[6-7]。

3.2血管反應(yīng)性及內(nèi)皮完整性的測定 首先用高鉀溶液刺激血管，檢測血管的反應(yīng)性。把浴槽內(nèi)的K-H 液換成高鉀K-H 液，使冠脈產(chǎn)生張力，維持5 min 后，充分沖洗(沖洗4次，每次間隔5 min)至基線，靜息30 min 后，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。前后2次高鉀刺激后，血管收縮的幅度相差不超過10%可用于下一步實(shí)驗(yàn)。為檢測血管內(nèi)皮的完整性，重新平衡血管環(huán)30 min，先用血管收縮劑100 nmol/L U46619 引起血管持續(xù)性收縮，再加入血管舒張劑1 μmol/L 乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)，若血管的舒張幅度大于60%，視為內(nèi)皮完整，若ACh不能使預(yù)先收縮的血管舒張，或者舒張程度小于10%，說明內(nèi)皮去除完全。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

以2次高鉀誘發(fā)收縮張力的均值作為標(biāo)準(zhǔn)值(100%)，各血管收縮劑誘發(fā)的張力變化的幅度用百分比來表示; 血管舒張劑是以收縮劑誘發(fā)的最大穩(wěn)定收縮幅度定為標(biāo)準(zhǔn)值(100%)，血管舒張/收縮的幅度以占標(biāo)準(zhǔn)值的百分比來表示，半數(shù)有效濃度(median effect concentration，EC50)表示產(chǎn)生 50% 最大效應(yīng)時的藥物濃度, pEC50= -lg(EC50)。采用 Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，繪制收縮及舒張曲線，求得 lgEC50和最大收縮或舒張百分比的變化值(Emax)。用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。兩組之間的顯著性差異應(yīng)用雙側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間均數(shù)的兩兩比較使用LSD法和SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 5-HT2A受體阻斷劑和PLC抑制劑對5-HT誘導(dǎo)的冠狀動脈收縮反應(yīng)的影響

給予單劑量(2 μmol/L) 5-HT使冠狀動脈收縮，達(dá)到平臺后，用5-HT2A受體阻斷劑sarpogrelate (1 μmol/L)可完全阻斷5-HT引起的冠狀動脈收縮(P<0.01)，見圖1A、B。

采用累積給藥法加入5-HT(0.01～10 μmol/L)，可誘導(dǎo)冠狀動脈呈濃度依賴性收縮；K-H液洗4次后，加入PLC特異性抑制劑U73122 (10 μmol/L和50 μmol/L),孵育30 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個濃度的U73122均可阻斷5-HT引起的冠狀動脈收縮(P<0.01)，見圖1C、D及表1。

Figure 1. The effect of sarpogrelate and U73122 on vasoconstriction induced by 5-HT in endothelium-denuded coronary arterial rings from Wistar rats. A: representative recordings of vasoconstriction induced by 5-HT, then upon addition of sarpogrelate; B: sarpogrelate at 1 μmol/L significantly inhibited the contraction induced by 5-HT; C: representative recordings of concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT; D: U73122 at 10 μmol/L and 50 μmol/L significantly inhibited the contraction induced by 5-HT in a dose-dependent manner. Mean±SEM.n= 4.△△P<0.01vs5-HT group;**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsU73122 10 μmol/L group.

圖15-HT2A受體阻斷劑sarpogrelate和PLC抑制劑U73122對5-HT誘導(dǎo)的冠脈收縮的影響

2 Rottlerin 和Y-27632對5-HT誘導(dǎo)的冠狀動脈收縮反應(yīng)的影響

2.1Rottlerin可抑制5-HT誘導(dǎo)的冠狀動脈收縮反應(yīng) 用上述方法記錄5-HT累積給藥后冠狀動脈張力變化，再加入PKC抑制劑rottlerin 3 μmol/L和10 μmol/L孵育30 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 μmol/L的rottlerin可阻斷5-HT引起的冠狀動脈收縮(P<0.01)，見圖2A、B及表1。

2.2Y-27632可抑制5-HT誘導(dǎo)的冠狀動脈環(huán)的收縮反應(yīng) 同法記錄5-HT累積給藥后冠狀動脈張力變化，再加入Rho相關(guān)蛋白激酶抑制劑Y-27632 3 μmol/L和10 μmol/L孵育30 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個濃度的Y-27632均可明顯阻斷5-HT引起的冠狀動脈收縮(P<0.01)，見圖2C、D及表1。

表1 5-HT誘導(dǎo)的冠狀動脈收縮的pEC50和Emax (%)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vslow concentration group.

Figure 2. The effect of rottlerin and Y-27632 on vasoconstriction induced by 5-HT in endothelium-denuded coronary arterial rings from Wistar rats. A: representative recordings of concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT in the presence of rottlerin; B: rottlerin at 10 μmol/L significantly inhibited contraction induced by 5-HT; C: representative recordings of concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT in the presence of Y-27632; D: Y-27632 at 3 μmol/L and 10 μmol/L significantly inhibited contraction induced by 5-HT. Mean±SEM.n=8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsrottlerin 3 μmol/L group.

圖2PKC抑制劑rottlerin和Rho相關(guān)蛋白激酶抑制劑Y-27632對5-HT誘導(dǎo)的冠脈收縮的影響

3 Nifedipine可抑制5-HT誘導(dǎo)的冠狀動脈環(huán)收縮反應(yīng)

同法記錄5-HT累積給藥冠狀動脈張力變化，再加入L-型鈣通道阻斷劑nifedipine 1 μmol/L孵育30 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)nifedipine可明顯阻斷5-HT引起的冠狀動脈收縮，見圖3、表1。

Figure 3. The effect of nifedipine on vasoconstriction induced by 5-HT in endothelium-denuded coronary arterial rings from Wistar rats. A: representative recordings of concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT; B: nifedipine at 1 μmol/L significantly inhibited contraction induced by 5-HT. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsnifedipine 1 μmol/L group.

圖3L-型鈣通道阻斷劑nifedipine對5-HT誘導(dǎo)的冠脈收縮的影響

4 SKF96365和2-APB對5-HT誘導(dǎo)的冠狀動脈收縮反應(yīng)的影響

4.1SKF96365可抑制5-HT誘導(dǎo)的冠狀動脈環(huán)的收縮反應(yīng) 同法記錄5-HT累積給藥后冠狀動脈張力變化，再加入鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(store-operated Ca2+entry,SOCE)抑制劑SKF96365 10 μmol/L和30 μmol/L孵育30 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個濃度的SKF96365均可阻斷5-HT引起的冠狀動脈收縮，見圖4A、B及表1。

4.22-APB可抑制5-HT誘導(dǎo)的冠狀動脈環(huán)的收縮反應(yīng) 同法記錄5-HT累積給藥后血管張力的變化，再加入SOCE抑制劑2-APB 50 μmol/L和100 μmol/L孵育30 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予的2個濃度2-APB均可阻斷5-HT引起的冠狀動脈收縮，見圖4C、D及表1。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)5-HT2A受體阻斷劑sarpogrelate可完全消除5-HT引起的冠狀動脈收縮；PLC抑制劑U73122、Rho相關(guān)蛋白激酶抑制劑Y-27632和PKC抑制劑rottlerin均可明顯抑制5-HT引起的冠狀動脈收縮；L型鈣通道(Cav1.2)阻斷劑nifedipine及SOCE抑制劑SKF96365和2-APB孵育后，5-HT誘導(dǎo)血管收縮張力較未處理組明顯下降；同時，在含nifedipine的無鈣K-H液中，發(fā)現(xiàn)5-HT仍可誘導(dǎo)血管收縮。

Sarpogrelate為5-HT2A受體阻斷劑，具有抑制血小板聚集的作用，已應(yīng)用于多種心血管疾病的治療，如糖尿病、冠心病和動脈粥樣硬化等。5-HT受體包括7個類型(5-HT1-7)，除了5-HT3受體家族屬于配體門控陽離子通道，其它5-HT受體家族均屬于跨膜G蛋白偶聯(lián)受體。而參與冠狀動脈收縮的相關(guān)受體主要有5-HT1B和5-HT2A[8-9]，本實(shí)驗(yàn)給予sarpogrelate干預(yù)后發(fā)現(xiàn)可完全消除5-HT引起的冠狀動脈收縮，提示冠狀動脈中是5-HT2A受體介導(dǎo)5-HT效應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)，5-HT可與VSMCs的細(xì)胞膜相應(yīng)受體結(jié)合，激活PLC，使磷脂酰肌醇二膦酸(phosphatidylinositol bisphosphate，PIP2)分解為IP3和DAG。IP3與受體結(jié)合，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+排空，激活Ca2+內(nèi)流通道，從而介導(dǎo)外鈣內(nèi)流，誘導(dǎo)血管收縮[10]。DAG激活PKC，使PKC增強(qiáng)性抑制蛋白17磷酸化，抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性，使其不易去磷酸化，導(dǎo)致平滑肌產(chǎn)生收縮增強(qiáng)[11]。U73122為PLC抑制劑，通過抑制PIP2水解為IP3，使細(xì)胞內(nèi)Ca2 +的下降；Y-27632為Rho相關(guān)蛋白激酶特異性抑制劑，可靶向結(jié)合ROCK-1和ROCK-2的催化位點(diǎn)，從而抑制其活性[12]。本實(shí)驗(yàn)分別給予PLC/PKC/Rho激酶通路的抑制劑干預(yù)，發(fā)現(xiàn)均可明顯抑制5-HT引起的冠狀動脈環(huán)收縮，提示冠狀動脈中5-HT2A受體介導(dǎo)冠脈收縮可能與PLC/PKC/Rho激酶信號通路有關(guān)。

此外，Ca2+作為第二信使，在平滑肌細(xì)胞中參與細(xì)胞收縮過程[13]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+通過與鈣調(diào)蛋白結(jié)合后激活肌球蛋白輕鏈激酶，使肌球蛋白輕鏈磷酸化，導(dǎo)致肌動蛋白和肌球蛋白相互作用引起血管收縮。細(xì)胞膜上參與細(xì)胞內(nèi)外鈣離子交換的主要通道有：電壓操縱性鈣通道(voltage-gated calcium channel, VGCC)、SOC和受體操縱性鈣通道(receptor operated calcium channel, ROCC)[14]。Sung等[15]發(fā)現(xiàn)在大鼠腸系膜動脈中，硝苯地平可顯著降低5-HT誘導(dǎo)的動脈收縮。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度紊亂可引起冠狀動脈收縮功能障礙。為研究冠狀動脈VSMCs外鈣離子交換的主要通道，本實(shí)驗(yàn)給予鈣通道阻滯劑nifedipine，可阻斷L-型鈣通道抑制鈣內(nèi)流進(jìn)入VSMCs；SKF96365和2-APB為SOCE抑制劑，可阻斷SOCE從而降低胞質(zhì)Ca2+，減少細(xì)胞外鈣的進(jìn)入[16]。本研究發(fā)現(xiàn)nifedipine、SKF96365和2-APB孵育后，5-HT誘導(dǎo)血管收縮張力較未處理組均明顯下降；同時，在含nifedipine的無鈣K-H液中，發(fā)現(xiàn)5-HT仍可誘導(dǎo)血管收縮，說明Cav1.2、SOC和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放可能與5-HT介導(dǎo)的冠狀動脈收縮有關(guān)。

Figure 4. The effect of SKF96365 and 2-APB on vasoconstriction induced by 5-HT in endothelium-denuded coronary arterial rings from Wistar rats. A: representative recordings of concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT in the presence of SKF96365; B: SKF96365 at 10 μmol/L and 30 μmol/L significantly inhibited contraction induced by 5-HT in a dose-dependent manner; C: representative recordings of concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT in the presence of 2-APB; D: 2-APB at 50 μmol/L and 100 μmol/L significantly inhibited contraction induced by 5-HT in a dose-dependent manner. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSKF96365 10 μmol/L group;△△P<0.01vs2-APB 50 μmol/L group.

圖4SOCE抑制劑SKF96365和2-APB對5-HT誘導(dǎo)的冠脈收縮的冠脈收縮的影響

本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠冠狀動脈張力的測定，發(fā)現(xiàn)5-HT通過激活5-HT2A受體誘導(dǎo)冠狀動脈收縮，可能與PLC/PKC/Rho信號通路，以及L-型鈣通道和SOC通道相關(guān)的鈣調(diào)控有關(guān)，為相關(guān)疾病的治療用藥帶來更多選擇。但本實(shí)驗(yàn)僅對離體大鼠冠狀動脈進(jìn)行了分析，并未在細(xì)胞學(xué)水平對可能參與的信號通路進(jìn)行深入研究，以進(jìn)一步確定其上下游關(guān)系；且大鼠與人的冠狀動脈存在種屬間的差異，是其局限性。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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