芥子堿對H2O2誘導BMSCs成脂分化的影響*

黃煒平， 李 可， 劉愛軍， 陳東風， 王洪琦

(廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院， 廣東 廣州 510006)

《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告》指出近十年來居民膳食脂肪功能比超過30%，由肥胖引起的一系列嚴重合并癥如高血壓病和胰島素抵抗等對人類的健康構成了嚴重的威脅。肥胖是由于脂肪細胞的數量增多和體積增大所致，而脂肪細胞已被證實來源于骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)。BMSCs是一類來源于中胚層的具有多向分化潛能的干細胞，具有高度的增殖能力，易純化，均一性好，又因其低免疫源性和可移植性，被認為是組織工程學的種子細胞，在細胞移植和基因治療方面得到廣泛關注[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，中藥在調控BMSCs成脂分化中發(fā)揮積極作用[3-6]，芥子堿(sinapine)作為輕身藥萊菔子的有效成分，對BMSCs成脂分化的作用尚未見到相關報道。考慮氧化應激會增加不正常脂肪細胞的形成進而加大肥胖的發(fā)生率[7-8]，因而本實驗采用低濃度過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導BMSCs成脂分化作為模型，旨在探討中藥單體芥子堿對氧化應激引起B(yǎng)MSCs向脂肪細胞分化的影響，進一步了解芥子堿的藥理作用。

材 料 和 方 法

1 實驗材料與儀器

SPF級雄性SD大鼠購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(粵)2013-0034， 使用程序符合《廣州中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會章程》。

芥子堿硫氰酸鹽購自廣東省藥品檢驗所(編號62.111702，CAS No.: 7431-77-8)；DMEM低糖培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清和0.25% EDTA-胰蛋白酶均購自Gibco；SD大鼠骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基購自賽業(yè)生物科技有限公司； 抗CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5.5和CD90-PE流式抗體購自Abcam；CCK-8試劑盒購自Dojindo；油紅O粉末購自Sigma；蘇木素染色液由廣州中醫(yī)藥大學張賽霞老師提供；30% H2O2購自天津市精細化學制劑廠；抗過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)抗體購自Santa Cruz；抗葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4, Glut4)抗體購自Abclonal； 抗脂肪細胞蛋白2(adipocyte protein 2，aP2)抗體、 HRP標記的羊抗免IgG和HRP標記的羊抗鼠IgG均購自Abcam；抗β-actin抗體(貨號M0627)購自博士德公司；引物購自上海生工；TRIzol總RNA抽提試劑、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和GeneRuler 100 bp DNA Ladder均購自Thermo Fisher；Talent qPCR PreMix(SYBR Green)購自Tiangen。

移液器(Eppendorf)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo 150i)；倒置顯微鏡(Motic AE2000)；流式細胞儀(BD)；多功能酶標儀(EnSpire)；圖像分析系統(tǒng)(Olympus)；紫外分光光度計(BioSpec-Nano)；電泳轉膜裝置(Bio-Rad)；PCR儀(Bio-Rad T100)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96)；全自動化學發(fā)光圖像分析儀(Tanno 5200)等。

2 方法

2.1大鼠BMSCs的獲取 選取60～80 g健康雄性SD大鼠，乙醇浸泡15 min后采用頸椎脫位法處死大鼠，碘伏消毒手術暴露骨髓腔，用10 mL注射器抽吸含1%雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基反復吹打骨髓腔，吸取含骨髓的培養(yǎng)基于15 mL離心管常溫離心(1 000 r/min)8 min，棄上清，獲取細胞。所獲取的BMSCs采用全骨髓培養(yǎng)法，將細胞用含10% FBS和1%抗生素的專用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，24 h后半量換液，96 h后全量換液，此后每隔2～3 d換液。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況以及有無污染等并拍照。

2.2鑒定BMSCs表面標志物 待P3細胞長至融合90%左右，常規(guī)消化細胞并離心(1 000 r/min) 8 min，棄上清。預冷PBS洗滌2遍并離心棄上清，500 μL PBS重懸細胞(此時細胞數至少為1.0×106以上)，實驗分為空白對照組、同型對照組和實驗組。每個流式管中分別吸取細胞懸液50 μL并加入不同標記抗體5 μL。室溫避光孵育30 min，2 mL PBS溶液洗滌2遍以除去未結合抗體。離心后垂直倒掉上清液，分別用200 μL PBS重懸細胞，上流式細胞儀進行檢測分析。實驗重復3次，用FlowJo 7.6軟件分析數據。

2.3CCK-8法檢測芥子堿對BMSCs的毒性作用 取對數生長期BMSCs(P3)按照細胞密度每孔4.0×103接種于96孔板，待細胞融合70% 以上，棄細胞培養(yǎng)基，加入含藥芥子堿的條件培養(yǎng)基，設置濃度梯度為5、10、20、40、80、160和320 μmol/L，同時設單細胞懸液不加藥物的正常對照(normal control)組及無細胞培養(yǎng)液的空白對照(blank control)組。孵育24 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液和100 μL新鮮完全培養(yǎng)基，混勻后置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后，多功能酶標儀于490 nm處檢測吸光度，實驗重復3次，每組6個復孔。

2.4BMSCs成脂分化模型的建立和實驗分組設計 實驗中模型的建立參照文獻[9-10]并作修改，選取生長狀態(tài)良好的BMSCs，待其生長融合85%左右，采用含H2O2無血清培養(yǎng)基(終濃度200 μmol/L)誘導BMSCs 1 h之后棄誘導液，更換成條件培養(yǎng)基。整體實驗設計分組如下：正常對照(control)組、H2O2模型(model)組和芥子堿(sinapine)組。模型組和芥子堿組用無血清培養(yǎng)基稀釋H2O2進行成脂分化誘導，同時正常對照組加上相同體積的無血清培養(yǎng)基統(tǒng)一條件。1 h后正常對照組和模型組更換成完全培養(yǎng)基，芥子堿組換成含藥培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行檢測。

2.5油紅O染色實驗及半定量分析 按照每孔1.0×105的密度將細胞接種于24孔板中，孵育結束后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min。棄固定液，PBS洗2遍，每孔加入適量60%異丙醇，室溫放置5 min。完全棄掉異丙醇，每孔加入300 μL 60%油紅O工作液，室溫放置25 min。快速去掉油紅染料，60%異丙醇速洗1遍，雙蒸水洗3遍。棄雙蒸水，蘇木素染色15 s 后棄染色液，自來水洗3～4遍，甘油明膠封片。在圖像分析系統(tǒng)下觀察并隨機選取5個視野拍攝照片。半定量分析不進行蘇木素染色，油紅染色結束并洗去多余染料后加入300 μL 100%異丙醇，在搖床中放置10 min，使細胞內的油紅充分溶解，用移液器吸50 μL混合液于96孔板中，同時設立陰性對照組，多功能酶標儀于570 nm處檢測吸光度，實驗重復3次，每組5個復孔。

2.6Western blot測PPARγ、aP2和Glut4的蛋白表達 棄舊液，預冷PBS洗2遍，加入適量裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)用刮刀收集細胞于1.5 mL EP管中，冰上裂解30 min，超聲5 min，離心(12 000 r/min)15 min，取上清，BCA蛋白定量將樣品濃度調整一致后煮沸變性。蛋白樣品30～50 μg于10%分離膠中電泳(條件為80 V 30 min、120 V 60 min)；濕轉(條件為300 mA 80 min)于PVDF膜上。室溫封閉 2 h，I 抗4 ℃過夜或者室溫孵育2 h；TBST洗脫6次，每次5 min， 加入II抗室溫孵育1 h；TBST洗脫6次，每次5 min, 后曝光。所有抗體用5% BSA稀釋，比例參照說明書。ECL化學發(fā)光工作液配合天能全自動化學發(fā)光圖像分析儀曝光條帶。應用ImageJ圖像分析軟件分析各組條帶灰度值后進行統(tǒng)計學分析。

2.7qPCR法檢測PPARγ、aP2和Glut4的mRNA表達 采用經典TRIzol-氯仿的方法抽提總RNA，檢測濃度和純度后，取1 μg進行逆轉錄合成第一鏈cDNA，具體方法按照說明書操作。逆轉錄條件為 65 ℃ 反應5 min，結束后置于冰上，此后是42 ℃ 反應60 min，升溫至70 ℃ 反應5 min，降溫至4 ℃。qPCR采用一步法，具體操作參照說明書。反應體系為15 μL。反應條件為95 ℃預變性反應3 min; 95 ℃變性反應5 s、60 ℃退火/延伸反應15 s，采集熒光信號并循環(huán)40次，最后繪制熔解曲線。采用2-ΔΔCt法分析統(tǒng)計各基因表達差異。引物序列見表1。

表1 qPCR的引物序列

3 統(tǒng)計學處理

所有數據輸入Excel 2016、SPSS 20、GraphPad Prism 7統(tǒng)計軟件進行整理和統(tǒng)計作圖，以均數±標準差(mean±SD)表示，樣品多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 BMSCs的形態(tài)學觀察及流式細胞術鑒定

倒置顯微鏡下觀察體外分離所培養(yǎng)的原代大鼠BMSCs，P0和P1細胞混雜造血干細胞，經過換液傳代，鏡下觀察細胞貼壁速度較快，呈現(xiàn)成纖維細胞外觀，大部分為梭形，見圖1A；隨著傳代次數增加，細胞形態(tài)、排列趨于一致，大量擴增后可見漩渦狀排列，見圖1B。流式細胞術檢測第3代BMSCs，結果顯示BMSCs高表達CD29、CD44和CD90，低表達CD45，其陽性率分別為99.79%、89.77%、99.41%和3.76%，證明按照上述方法培養(yǎng)BMSCs，至第3代細胞純度較高，未見分化，可用于下一步實驗，見圖1C。

2 CCK-8法檢測芥子堿對BMSCs的毒性作用

不同濃度的芥子堿對BMSCs作用24 h后對細胞活性有不同的影響。結果提示當藥物濃度<40 μmol/L，芥子堿對BMSCs的活力影響較小；當藥物濃度>40 μmol/L，隨著芥子堿藥物濃度的升高，BMSCs的活力明顯被抑制(P<0.01)，見圖2A。在此基礎上，對藥物芥子堿低濃度范圍內再次進行CCK-8實驗，結果顯示與正常對照組比較，濃度為15 μmol/L時，芥子堿對BMSCs的活力影響最小，見圖2B。為確定芥子堿對BMSCs成脂分化的最佳有效濃度，選取5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L 4個濃度進行油紅O半定量實驗。

Figure 1. Culture and identification of BMSCs. A: BMSCs, P3 (×200); B: large numbers of expanded BMSCs, P3 (×100); C: flow cytometric analysis.

圖1骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)與鑒定

Figure 2. The toxicity of sinapine at different concentrations on the BMSCs. A: high concentration range; B: low concentration range. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2CCK-8法檢測不同濃度芥子堿硫氰酸鹽對BMSCs的毒性作用

3 油紅O半定量及染色實驗分析H2O2及芥子堿對BMSCs的影響

油紅O半定量結果顯示，H2O2模型組與正常對照組比較吸光度增加，提示H2O2明顯促進BMSCs成脂分化，脂滴含量明顯較多；而與模型組比較，隨著芥子堿藥物濃度的增加，BMSCs成脂分化的趨勢明顯受到抑制，見圖3A。結合CCK-8實驗結果，最終選取芥子堿濃度15 μmol/L進行實驗。另外油紅O染色結果顯示，相對于正常未分化的BMSCs，經過H2O2誘導1 h后，包繞在細胞核周圍的脂滴數量明顯增多，更為直觀地提示H2O2可促進BMSCs成脂分化；而藥物芥子堿濃度15 μmol/L作用細胞24 h后脂滴數量明顯減少，提示芥子堿抑制由H2O2誘導的BMSCs成脂分化過程，見圖3B。

Figure 3. Oil Red O assay. A: the optimum and effective concentration of sinapine was selected by Oil Red O semi-quantitative assay; B: observation of the effect of sinapine at 15 μmol/L on the adipogenic differentiation of BMSCs induced by H2O2(×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖3油紅半定量及染色實驗結果

4 芥子堿對H2O2誘導BMSCs成脂分化過程中PPARγ、aP2和Glut4的影響

以aP2、PPARγ和Glut4的表達情況來分析芥子堿作用于BMSCs 24 h后對其成脂分化的影響。Western blot結果顯示相對于正常對照組，H2O2模型組中aP2、PPARγ和Glut4的蛋白表達水平均升高(P<0.01)；而相比較H2O2模型組，芥子堿降低aP2、PPARγ和Glut4的表達(P<0.05)，見圖4A。qPCR結果同樣顯示在轉錄層面，H2O2模型組中aP2、PPARγ和Glut4基因的mRNA水平明顯高于正常對照組(P<0.01)和加藥芥子堿組(P<0.01)，其中對PPARγ的轉錄調控最為明顯，見圖4B。Western Blot和qPCR結果均提示芥子堿能夠降低H2O2誘導的BMSCs中脂肪分化相關蛋白的表達。

討 論

1 H2O2可以促使BMSCs向脂肪細胞分化

肥胖會增加患心臟病、中風和糖尿病等疾病的風險，有資料明確表明氧化應激、肥胖和脂肪細胞這三者之間關系密切，氧化應激的增加會加速脂肪的累積進而引發(fā)代謝綜合征，因而脂肪組織中的氧化還原狀態(tài)是肥胖相關代謝綜合征的一個潛在治療靶點[10]。基于此，本研究利用H2O2創(chuàng)造氧化應激環(huán)境以促進BMSCs成脂分化作為模型。前期已有文獻報道低濃度H2O2誘導1 h對BMSCs增殖沒有影響[11]，而后續(xù)補充的油紅O、qPCR以及Western blot實驗結果證明該模型的可行性。

2 芥子堿可以抑制BMSCs成脂分化，可能與其能夠抑制脂質過氧化反應相關

中醫(yī)理論認為肥胖之人身重氣虛，不良于行，因而中藥的功效中有了“輕身”這一詞。萊菔子最早見于《日華子本草》，是十字花科植物萊菔的成熟種子，為健脾輕身藥的一種，有降氣化痰和消食除脹之功?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)芥子堿廣泛存在于十字花科植物中，其在自然界常與有機酸結合成鹽的形式存在，其中以芥子堿硫氰酸鹽的形式存在最為廣泛。芥子堿具有抗氧化、抗輻射、抗衰老、抗增殖、抗凋亡、降血壓及促進腸胃蠕動等作用[12-18]。又有研究表明芥子堿硫氰酸鹽作為萊菔子水溶性生物堿的主要成分，能夠提高高密度脂蛋白膽固醇的含量，進而增強血脂代謝能力[19-20]。本實驗通過檢測不同濃度的芥子堿作用于細胞24 h后的光吸收度，結果提示芥子堿在濃度<40 μmol/L條件下對BMSCs幾乎沒有毒性，對其增殖抑制沒有顯著影響；隨后采用H2O2誘導BMSCs成脂分化作為模型，通過油紅O半定量及染色實驗又發(fā)現(xiàn)芥子堿組脂滴數量減少，光吸收度降低，細胞形態(tài)逐漸呈纖維狀。提示芥子堿能夠逆轉氧化反應形成的脂質化，明顯抑制BMSCs向脂肪細胞方向分化。

Figure 4. The effects of sinapine on the expression of aP2, PPARγ and Glut4 at mRNA and protein levels in H2O2-induced BMSCs. A: Western blot for determining the relative protein expression of aP2, PPARγ and Glut4 in the BMSCs (n=4); B: qPCR for detecting the relative mRNA expression of aP2, PPARγ and Glut4 in the BMSCs (n=3). Mean±SD.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖4芥子堿硫氰酸鹽對H2O2誘導BMSCs成脂分化過程中aP2、PPARγ和Glut4表達的影響

芥子堿結構的苯環(huán)帶有羥基可形成化合物酚，酚類化合物具有清除氧自由基抗氧化作用，近年來有研究揭示芥子堿是一種非常有價值的天然抗氧化劑。人類疾病中如腫瘤、血管硬化及衰老等現(xiàn)象都涉及脂質過氧化作用，生物堿降血脂一般通過提高高密度脂蛋白膽固醇含量、抑制脂質過氧化、增強抗氧化酶活性等途徑降低血脂[21]，因而我們推測芥子堿亦可能是通過上述途徑抑制BMSCs成脂分化。

3 芥子堿可以抑制BMSCs成脂分化，其機制或與AMPK和PPARγ信號通路有關

BMSCs具有多向分化潛能，給予適當的條件，細胞便可以定向分化，本研究通過流式細胞鑒定術可以鑒定原代BMSCs培養(yǎng)至第3代，其純度高且細胞未分化。有研究報道，在完全分化的脂肪細胞中，PPARγ即使被敲低細胞仍然能保留其脂肪細胞的表型，表明在完全分化的脂肪細胞中，PPARγ可能不是維持脂肪細胞表型的必要條件，另外通過雙重siRNA干擾方法，發(fā)現(xiàn)了PPARγ功能的缺失正是由Glut4和Glut1介導引起的[22]。除此之外有實驗通過構建shRNA腺病毒載體靶向PPARγ基因，發(fā)現(xiàn)該載體能夠有效阻斷BMSCs或者3T3-L1等未完全分化細胞內PPARγ mRNA表達進而抑制其成脂分化，并且Glut4的表達亦有下調[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)在早期未分化的BMSCs中可觀察到PPARγ與C/EBPα關系密切，同時介導aP2的轉錄并互為正反饋調控促進BMSCs成脂分化[24-25]。在本次研究中發(fā)現(xiàn)芥子堿對BMSCs成脂分化的一些關鍵基因的表達具有影響。Western blot和qPCR提示與正常未分化的BMSCs相比，芥子堿組中aP2、PPARγ和Glut4表達量變化不一致，但明顯低于模型組。

將PPARγ、aP2和Glut4通過蛋白富集分析發(fā)現(xiàn)，Glut4位于AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號通路，aP2位于PPARγ信號通路，三者均是BMSCs成脂分化中的關鍵轉錄因子，主要功能體現(xiàn)在正向調控棕色脂肪細胞的分化[26]。早期有報道AMPK與PPARγ信號通路在3T3-L1細胞成脂分化中存在相互交叉的關系，共同調節(jié)脂肪細胞的形成[27]。芥子堿能夠抑制BMSCs成脂分化，其機制可能與AMPK和PPARγ信號通路有關。

綜上所述，本研究采用低濃度H2O2誘導BMSCs建立成脂分化細胞模型，芥子堿作用于該模型可明顯抑制BMSCs向脂肪細胞分化，但其具體機制尚未明確，上述兩種推測有待進一步實驗證明。

致謝：流式細胞術檢測由中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院流式細胞室工作人員完成，感謝科室老師的幫助！

[參 考 文 獻]

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