營養(yǎng)型酵母細胞破壁方法的研究

康 潔

(商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院，河南 商丘 476000)

啤酒酵母細胞營養(yǎng)物質(zhì)十分豐富，除含有大量的蛋白質(zhì)外，還具有維生素B和豐富的鈣、鐵、鉻等微量元素[1，2，3]，還含有人體所必需的8種氨基酸[4]，所以，酵母細胞一直被作為食品添加劑和飼料添加劑，加入食品、飼料里，飲料、酒類和調(diào)味品生產(chǎn)也常常使用[5，6，7].然而，酵母細胞壁不易破裂，細胞內(nèi)容物不易被充分吸收利用[8]，因此影響了啤酒酵母深度開發(fā)和利用.目前，國內(nèi)研究酵母細胞破壁的報道也有[9，10]，但實用效果不是太好，我們利用食用的安琪酵母為材料，設(shè)計了4種破壁方法的正交實驗，并進行統(tǒng)計分析和破壁率比較，以期找到能在食品開發(fā)生產(chǎn)中使用的酵母細胞的破壁方法.

1 材料與方法

1.1 材料試劑與設(shè)備

市獸安琪酵母，馬鈴薯產(chǎn)于商丘荷蘭土豆品種，小牛血清，上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司；考馬斯亮藍G-250、葡萄糖、瓊脂、乳酸、美藍染色液、氯化鈉、氫氧化鈉等購于天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司.

超聲波細胞破碎機，上海和呈儀器制造有限公司；OLYMPUS相差顯微鏡；UV2003紫外可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司；無菌操作臺、高壓蒸汽滅菌鍋，常州國華電器有限公司；分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司.

1.2 方法

1.2.1 酵母細胞復(fù)蘇培養(yǎng)及擴大培養(yǎng)

稱取0.2 g酵母粉，于無菌環(huán)境下加入適量無菌水，混勻后，參考文獻[11，12]涂布于馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基.將接種后的培養(yǎng)基置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h，至菌斑生成.

在無菌操作臺上挑取啤酒酵母菌斑少許，轉(zhuǎn)至馬鈴薯葡萄糖乳酸培養(yǎng)液中[13]，并在28 ℃下擴大培養(yǎng)20 h，收集細胞，離心，保存?zhèn)溆?

1.2.2 細胞溶出蛋白質(zhì)含量的測定

紫外光分光光度法測定蛋白.

參考文獻[14]制作小牛血清標(biāo)準(zhǔn)曲線：取11支試管，分別加入0、2.5 μL、5 μL、7.5 μL、10 μL、12.5 μL、15 μL、17.5 μL、20 μL、22.5 μL、25 μL的1 mg/mL BSA溶液，再用0.2 mol/L PBS補充到20 μL.最后分別加入1 mL考馬斯亮蘭G250試劑，在旋渦混合器上混合；2 min后，測定各樣品在595 nm處的光吸收值；以血清蛋白含量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=0.0136x+0.3459(R2=0.9911).

吸取1 mL酵母細胞破壁后的上清液1 mL，按上述方法測蛋白含量，重復(fù)3次取平均值，折算破壁率.

1.2.3 酵母細胞破壁方法

將收集的酵母細胞與乙酸-乙酸鈉(pH4.7)混合制成200個/mL濃度的酵母細胞懸液，備用.

1.2.3.1 氯化鈉破壁

參考文獻[15]，結(jié)合本實驗室特點，將氯化鈉配置成3種濃度，如表1，取10 mL酵母細胞懸液，加入等體積的3種氯化鈉溶液，混合，設(shè)置3種破壁時間和三種溫度條件，進行正交實驗.對每組實驗結(jié)果進行臺盼藍染色和革蘭氏染色，顯微鏡觀察、計數(shù)、拍照，計算破壁率，同時按照1.2.3方法測破壁液的蛋白質(zhì)含量.

表1 氯化鈉破壁正交實驗表

Table1 orthogonal test table of sodium chloride

ANaCl濃度/(%)B時間/(h)C溫度/(℃)11.51.55022.02.06032.52.570

表2 氫氧化鈉破壁正交實驗表

Table2 orthogonal test table of sodium hydroxide

ANaOH濃度/(%)B時間/(h)C溫度/(℃)13.02.07024.52.58034.03.090

顯微鏡觀察法檢測，吸取少許破壁后的酵母細胞混合液于載玻片，用臺盼藍染液染色，破壁的酵母細胞則被染上藍色，沒有破壁的細胞不能被染上顏色.革蘭氏染色法檢測，吸取少許破壁后的酵母細胞混合液于載玻片，用革蘭氏染色，未破壁細胞為紫色，破壁的細胞成紅色.

1.2.3.2 氫氧化鈉破壁

參考文獻[16]將氫氧化鈉配置成三種濃度，如表2，取10 mL酵母細胞懸液，加入等體積的3種氫氧化鈉溶液，混合，設(shè)置3種破壁時間和3種溫度條件，進行正交實驗.對每組實驗結(jié)果進行臺盼藍染色和革蘭氏染色，顯微鏡觀察、計數(shù)、拍照，計算破壁率和破壁液蛋白質(zhì)含量，方法同1.2.3.1.

1.2.3.3 超聲波破壁

取10 mL的酵母細胞懸液于小容器中，再放置于超聲波細胞破碎機中，破壁.破壁條件設(shè)置如表3，進行正交實驗.對每組實驗結(jié)果進行臺盼藍染色和革蘭氏染色，顯微鏡觀察、計數(shù)、拍照，并計算破壁率和破壁液蛋白質(zhì)含量，方法同1.2.3.1.

表3 超聲波破壁正交實驗表

Table3 ultrasonic broken wall orthogonal experiment table

A間歇時間/(s)B連續(xù)工作次數(shù)/(次)C功率/(W)110105021515603202070

表4 反復(fù)凍融法破壁正交實驗表

Table4 orthogonal test table of repeated freeze-thaw broken wall

A融化溫度/(℃)B融化時間/(h)C冷凍時間/(h)D凍融次數(shù)/(次)1700.51.522801.02.033901.52.54

1.2.3.4 反復(fù)凍融法破壁

取10 mL的酵母細胞懸液于小試管，中間停頓條件全部保持一致，并反復(fù)放置冰柜與溫度水浴鍋之間凍融，冷凍溫度統(tǒng)一為-20 ℃，恒溫水域鍋溫度設(shè)定為3個梯度，如表4，進行四因素三水平實驗.對每組實驗結(jié)果進行臺盼藍染色和革蘭氏染色，顯微鏡觀察、計數(shù)、拍照，并計算破壁率和破壁液蛋白質(zhì)含量，方法同1.2.3.1.

1.2.3.5 兩種方法混合破壁

以破壁率及溶出蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，從1.2.3.1、1.2.3.2、1.2.3.3、1.2.3.4方法中優(yōu)化出最佳條件組合，并將其中兩種方法組合一起為一個實驗，雙法處理酵母細胞，每個實驗重復(fù)3次，計算破壁液溶出蛋白量，Excel整理分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化鈉法對酵母細胞的破壁

表5 氯化鈉破壁正交試驗結(jié)果表

圖1 顯微鏡下看到的破壁細胞(放大1000倍) Fig1 The broken cell seen under the microscope 注：a臺盼藍染色；b革蘭氏染色 Becareful：a Trypan blue staining；b Gram staining

圖1a和圖1b分別是酵母細胞經(jīng)1.5%氯化鈉在60 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)破壁后，經(jīng)臺盼藍染色和革蘭氏染色的效果圖.經(jīng)臺盼藍染色，破壁的酵母細胞被染上藍色，沒有破壁的細胞不能被染上顏色；經(jīng)革蘭氏染色，未破壁細胞為紫色，破壁的細胞成紅色.從圖1可以看出，在A1B2C2組合條件下，二者染色結(jié)果一致，說明細胞已破壁死亡.

2.2 氫氧化鈉法對酵母細胞的破壁

表6 氫氧化鈉破壁正交試驗結(jié)果表

2.3 超聲波法對酵母細胞的破壁

根據(jù)表3的超聲波破壁酵母細胞的正交實驗，通過染色、觀察、計數(shù)、蛋白測量計算破壁率，得出結(jié)果見表7.

表7 超聲波破壁正交試驗結(jié)果表

續(xù)表7

2.4 反復(fù)凍融法對酵母細胞的破壁

根據(jù)表4的反復(fù)凍融法破壁酵母細胞的正交實驗，通過染色、觀察、計數(shù)、計算破壁率，得出結(jié)果如表8.

表8 反復(fù)凍融法正交試驗結(jié)果表

2.5 4種破壁方法的比較

將4種酵母細胞破壁方法的破壁率結(jié)果進行整理，并繪制成折線圖2.從圖2看出，超聲波方法對酵母細胞的破壁率最高值94.13%，也是4種方法中破壁率最高的，但曲線波動較大，說明超聲波條件的選擇比較靈敏，對結(jié)果影響明顯，操作中要注意把握設(shè)定條件.由圖2還可以看出，反復(fù)凍融破壁率最大值雖次于超聲波，但曲線波動較小，說明不同凍融條件破壁的效果差異不大，操作中對破壁條件相對比較容易掌控.

圖2 4種方法破壁效果比較 Fig2 Comparison of wall breaking effects of four methods

2.6 混合法對酵母細胞的破壁效果

由于超聲波法破壁率最高，選擇超聲波A3B1C3條件，即超聲波功率在70 W、連續(xù)工作10次、間歇時間20 s，分別與氯化鈉、氫氧化鈉和反復(fù)凍融法組合成雙破壁法，計算破壁率，結(jié)果如表9.

表9 混合法破壁結(jié)果

表9顯示，3種混合法最后的破壁率無顯著差異(P>0.05)，但超聲波與氫氧化鈉混合的破壁率與氯化鈉混合的破壁率之間有差異(0.01

3 討 論

酵母細胞營養(yǎng)價值豐富，但是其細胞壁成分主要為β-葡聚糖和甘露聚糖[17]，通用的果膠酶和纖維素酶酶解破壁法往往效果不好，導(dǎo)致細胞營養(yǎng)不能充分利用.我們采用氯化鈉破壁、氫氧化鈉破壁、超聲波破壁、反復(fù)凍融法破壁4種方法，經(jīng)比較超聲波破壁法效果做好，在設(shè)定功率70 W、連續(xù)工作10次、間歇時間20 s條件下酵母細胞的破壁率可以達到94.13%，而經(jīng)過超聲波與氯化鈉破壁、氫氧化鈉破壁、反復(fù)凍融破壁分別結(jié)合，進行混合破壁后，破壁率不比單獨的超聲波高，3組混合的破壁率沒有顯著差異(P>0.05)，這說明超聲波破壁可以破壞酵母細胞壁的大分子結(jié)構(gòu)，而幾種化學(xué)物質(zhì)對酵母細胞壁的分子結(jié)構(gòu)破壞不大.除超聲破外，反復(fù)凍融對酵母細胞壁結(jié)構(gòu)也明顯的影響，在融化溫度90 ℃、時間1 h然后在-20 ℃條件下冷凍1.5 h，反復(fù)凍融4次，可以達到78.87%的破壁率.

酵母在食品加工、發(fā)酵飲料、做酒、酸乳、醤醋方面有很大用途，而能破壁的酵母細胞也可以應(yīng)用在食品加工行業(yè)作為添加劑，以期給食品增加許多風(fēng)味，也可以應(yīng)用在化妝品行業(yè)和飼料加工業(yè)[18]，近幾年酵母細胞因其含有大量的VB和礦物質(zhì)微量元素也被應(yīng)用在了保健品或營養(yǎng)強化劑[19]以及工程改造酵母菌株[20].因此，我們的研究成果對酵母細胞的充分利用，開拓應(yīng)用空間以及對功能食品的開發(fā)生產(chǎn)都具有深遠意義.

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