YAP表達與肝細胞癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系△

王翊凱，畢新宇，趙宏，趙建軍，李智宇，周健國，黃振，張業(yè)繁，陳曉，吳曉龍，茅銳，周彥池，劉劍梅，蔡建強

國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院肝膽外科，北京1000210

原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）居全世界惡性腫瘤發(fā)病率第6位，病死率居第3位。在中國肝癌病死率高居第2位，每年全世界因肝癌死亡的患者有一半以上來自中國[1]。年齡、性別、乙肝病毒感染、黃曲霉毒素感染、長期酗酒和肝硬化等都是HCC的發(fā)病危險因素[2]。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、門靜脈癌栓等是目前用于評估肝癌預(yù)后的常見危險因素，但是這些指標(biāo)預(yù)測肝癌患者術(shù)后遠期生存的效果有限[3-4]。因此，臨床上急需找到一些能有效預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的腫瘤標(biāo)志物，通過標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)高復(fù)發(fā)和高死亡風(fēng)險的肝癌患者并及時進行臨床干預(yù)。Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo信號通路下游的靶蛋白，在多種惡性腫瘤中呈異常表達和活化，并參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲、血管生成等多種生物學(xué)功能，因此YAP有可能成為一個新的腫瘤分子標(biāo)志物[5]。本研究通過對98例HCC患者術(shù)后腫瘤組織切片進行免疫組化染色，分析肝癌組織中YAP的表達情況及其與肝癌患者臨床特征及預(yù)后之間的關(guān)系，探討YAP在肝癌中的表達差異是否可作為預(yù)測肝癌術(shù)后預(yù)后的分子指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月至2011年12月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腹部外科收治的98例HCC患者的臨床資料，對98例HCC患者術(shù)后癌組織與癌旁組織的病理切片進行免疫組化染色。98例患者均接受了根治性切除術(shù)，術(shù)前均無遠處轉(zhuǎn)移，肝功能均為Child-Pugh A級，術(shù)后病理均證實為HCC，腫瘤分期按照2010年國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[6]劃分。本研究取得了所有研究對象及家屬的知情同意。

1.2 試劑來源

YAP抗體購自Cellsignal公司，為兔來源的單克隆抗體。二抗為山羊抗兔/鼠IgG抗體-辣根過氧化酶（HRP）多聚體，購自DAKO公司。

1.3 免疫組化方法及評價標(biāo)準(zhǔn)

病理標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋連續(xù)切片，厚4 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，抗原修復(fù)[YAP預(yù)處理：枸櫞酸緩沖液（0.01 μmol/L，pH值為6.0），微波95～98 ℃，維持12 min]，免疫組化方法采用非生物素二步法，常規(guī)免疫組織化學(xué)染色程序進行染色。YAP一抗工作濃度為1∶80，二抗工作濃度為1∶50。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知染色強陽性的組織切片作為陽性對照，用山羊血清代替一抗作為陰性對照，PBS代替一抗作為空白對照。

免疫組化判斷結(jié)果主要根據(jù)陽性細胞在全部組織細胞中所占比例以及陽性細胞染色強度。采用半定量積分法，每張切片隨機選擇5個視野，每個視野高倍鏡下計數(shù)100個細胞。①染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：不著色0分，黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分；②陽性細胞所占比例評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細胞數(shù)≤5%者0分，6%～25%者1分，26%～50%者2分，51%～75%者3分，＞75%者4分。上述兩項評分相乘后，0分為陰性（－），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。以（+）為界點，（－）為YAP陰性組，（+～+++）為YAP陽性組。

1.4 臨床隨訪

本組所有患者在術(shù)后前3年內(nèi)每3個月隨訪一次，3年后每半年隨訪一次。隨訪方式為門診復(fù)查、電話或上門隨訪，隨訪內(nèi)容包括肝功能檢查、腫瘤標(biāo)志物、胸部X線、腹部超聲檢查，對懷疑復(fù)發(fā)的病例行進一步的CT或MRI檢查。隨訪時間截至2017年1月，總生存期（overall survival，OS）和無進展生存期（relapse-free survival，RFS）分別指手術(shù)日到患者死亡和診斷為復(fù)發(fā)的時間，無終點事件的患者以隨訪截止時間為準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法進行生存分析，并采用Log-rank進行檢驗；采用Cox比例風(fēng)險模型進行單因素、多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YAP在肝癌組織、癌旁組織中的表達情況

YAP主要表達于腫瘤細胞核和細胞質(zhì)中。本研究98例肝癌組織中，YAP陰性77例，YAP弱陽性11例，YAP陽性9例，YAP強陽性1例，YAP陰性率為78.6%（77/98），YAP陽性率為21.4%（21/98），YAP高表達率為10.2%（10/98）。（圖1）

2.2 YAP表達情況與肝癌臨床特征的關(guān)系

采用Pearsonχ2檢驗分析YAP表達水平與各臨床特征間的關(guān)系。不同臨床特征患者的YAP蛋白表達情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

2.3 預(yù)后影響因素的單因素分析

本研究共選取12項可能影響肝癌患者術(shù)后生存的臨床特征，包括患者年齡、性別、臨床癥狀、乙肝表面抗原、術(shù)前AFP水平、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、有無肝硬化、大血管侵犯或存在瘤栓、腫瘤家族史、TNM分期和YAP表達狀態(tài)。單因素分析結(jié)果顯示，術(shù)前AFP水平、大血管侵犯或存在瘤栓、YAP表達狀態(tài)與患者術(shù)后RFS及OS有關(guān)（P＜0.05）。（表2）

2.4 預(yù)后影響因素的多因素分析

將上述單因素分析得出的3個影響患者術(shù)后預(yù)后的因素（AFP≥20 ng/ml、大血管侵犯或存在瘤栓、YAP表達陽性）帶入Cox回歸模型進行多因素分析，結(jié)果顯示AFP≥20 ng/ml、YAP表達陽性是影響患者術(shù)后RFS和OS的兩個獨立預(yù)后危險因素（P＜0.05）。（表 3）

圖1 YAP在肝癌中的表達（免疫組化染色，×400）

表1 YAP表達情況與HCC患者臨床特征的關(guān)系[ n（%）]

2.5 生存分析

根據(jù)YAP蛋白表達狀態(tài)繪制無復(fù)發(fā)生存曲線和總生存曲線。YAP陽性組、YAP陰性組的中位RFS分別為38.07、56.92個月，中位OS分別為54.43、63.43個月；YAP陽性組、YAP陰性組的3年無復(fù)發(fā)生存率分別為47.1%、84.2%，5年無復(fù)發(fā)生存率分別為41.2%、76.1%；YAP陽性組、YAP陰性組的3年總生存率分別為71.4%、87.0%，5年總生存率為57.1%、77.9%；YAP陽性組術(shù)后3、5年累積無復(fù)發(fā)生存率和總生存率均低于YAP陰性組（P＜0.05）。（圖2）

3 討論

手術(shù)是目前肝癌最有效的治療方法，但肝癌切除術(shù)后5年生存率并未顯著提高，研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后高復(fù)發(fā)率是影響生存的主要原因。臨床上發(fā)現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)的患者，根據(jù)肝癌復(fù)發(fā)的特征，可以選擇再次手術(shù)切除、局部消融、經(jīng)導(dǎo)管肝動脈化療性栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）、放療或系統(tǒng)治療等措施來延長患者的生存期。對于高危復(fù)發(fā)者，臨床研究證實術(shù)后TACE治療有一定的治療效果，TACE介入治療能發(fā)現(xiàn)并控制肝內(nèi)微小殘癌[7]。此外，對于伴有門靜脈癌栓的患者，術(shù)后經(jīng)門靜脈置管化療聯(lián)合肝動脈化療栓塞，也可明顯延長患者的生存期[8]。由此可見能夠早期發(fā)現(xiàn)高復(fù)發(fā)高死亡風(fēng)險的患者并及時進行干預(yù)是延長患者術(shù)后生存期的關(guān)鍵[9]。目前臨床上簡單的臨床特征已經(jīng)被證實難于進行有效的預(yù)測，如AFP是現(xiàn)在診斷肝癌和預(yù)測預(yù)后最常用的腫瘤標(biāo)志物，但臨床上有40%的小肝癌患者AFP呈假陰性[10]。因此尋找更多可以預(yù)測肝癌預(yù)后的有效分子生物學(xué)指標(biāo)具有重要的臨床意義。

表2 98例HCC患者術(shù)后RFS及OS影響因素的單因素分析

表3 98例HCC患者術(shù)后RFS和OS影響因素的多因素分析

圖298 例HCC患者無復(fù)發(fā)生存曲線和總生存曲線

YAP是Hippo信號通路的核心效應(yīng)因子，在調(diào)控細胞增殖和凋亡及組織器官大小方面起著重要作用[11]。YAP異常表達與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可引起肝癌細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡、逃逸等一系列生物學(xué)行為[12]。研究報道YAP是人類原發(fā)乳腺癌、肺癌、胃腸道惡性腫瘤中明確的癌基因[13-15]。在乳腺癌中，YAP在癌細胞細胞質(zhì)和細胞核中呈高表達，YAP的表達狀態(tài)可以預(yù)測乳腺癌患者術(shù)后的長期生存時間[16]。Liu等[17]報道YAP在膀胱移行上皮細胞癌中呈高表達狀態(tài)，并與癌細胞的增殖和侵襲密切相關(guān)，YAP可以作為膀胱癌的預(yù)后標(biāo)志物。

本研究免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中YAP陽性表達率為21.4%，YAP高表達率為10.2%。文獻報道，YAP在肝癌患者中普遍表達。本研究中YAP表達率不高，可能與入組患者例數(shù)較少有關(guān)。Cox多因素分析證實YAP表達陽性是影響HCC患者術(shù)后RFS和OS的獨立危險因素。生存分析發(fā)現(xiàn)YAP陽性組與YAP陰性組的中位RFS分別為38.07、56.92個月，中位OS分別為54.43、63.43個月，提示YAP陽性表達的HCC患者預(yù)后較差。

惡性腫瘤最大的特點是腫瘤細胞無限制地分裂，從而引起腫瘤的惡性增殖和進展[18]。研究發(fā)現(xiàn)，YAP與TEAD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后發(fā)揮促癌作用，YAP過表達代表調(diào)節(jié)細胞增殖分化、抗凋亡、負責(zé)細胞存活轉(zhuǎn)移的一組靶基因（CTCG、CCND1、ITGB2、BIRC5/survivin、BCL2L1、Ki-67、c-myc、AFP）的異常激活，尤其是與細胞增殖和腫瘤進展密切相關(guān)的基因（TEAD1和TEAD4）的異常激活[11,19-20]。此外，YAP還能抑制一些抑癌基因的表達，如DDIT4和Trail的表達，這些抑癌基因可以改變細胞的生物學(xué)行為，比如抑制增殖和侵襲行為，刺激血管再生等[21]。在細胞水平的研究中證實，過表達的YAP與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、錨定非依賴性生長等致癌特性密切相關(guān)，YAP與TEAD1共同調(diào)節(jié)EMT轉(zhuǎn)錄因子Zeb1，促進細胞增殖和EMT，減弱細胞間的緊密連接，從而增強腫瘤細胞的遷移侵襲能力，從而與肝癌的高復(fù)發(fā)特性具有顯著相關(guān)性[22]。本研究中YAP與HCC術(shù)后中位RFS和OS有關(guān)，與以上研究報道結(jié)果相符。本研究中YAP表達狀態(tài)與術(shù)前AFP水平、腫瘤直徑、腫瘤多發(fā)、肝硬化等病理因素?zé)o關(guān)，考慮為納入研究的例數(shù)較少引起。

Cox單因素分析表明，影響肝癌預(yù)后的因素包括術(shù)前AFP水平、大血管侵犯或存在瘤栓、YAP表達狀態(tài)。而腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、肝硬化、TNM分期這4個文獻中多次報道的影響肝癌預(yù)后的有效指標(biāo)，本組研究未得出顯著意義，考慮為98例患者例數(shù)較少且只有3例Ⅲ～Ⅳ期患者的原因。YAP陰性組患者的術(shù)后無復(fù)發(fā)生存率和總生存率高于YAP陽性組；YAP陽性組、YAP陰性組的3年無復(fù)發(fā)生存率分別為47.1%、84.2%，5年無復(fù)發(fā)生存率為41.2%、76.1%；YAP陽性組、YAP陰性組3年總生存率分別為71.4%、87.0%，5年總生存率為57.1%、77.9%，提示YAP參與了肝癌惡性生物學(xué)行為，促進肝癌的病情進展。更重要的是Cox多因素分析表明，YAP陽性表達、術(shù)前AFP≥20 ng/ml是影響肝癌術(shù)后預(yù)后的獨立危險因素，而且在Cox多因素回歸模型中YAP陽性表達在影響肝癌預(yù)后諸因素中權(quán)重較大，提示YAP對肝癌術(shù)后預(yù)后具有較好的預(yù)測價值。

綜上所述，YAP陽性組患者術(shù)后的RFS和OS降低，YAP陽性表達是HCC患者術(shù)后預(yù)后的獨立危險因素，YAP可以成為HCC診斷和術(shù)后預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)，針對YAP的靶向藥可能成為HCC新的治療方式。同時，本研究也有樣本量小和回顧性分析固有的偏倚存在，有待更多中心更大樣本量的研究來驗證。

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