AQP 9在As 2 O 3聯(lián)合AZT治療肝癌中的作用探討△

汪湄，陳徹，楚慧媛

甘肅中醫(yī)藥大學臨床學院，蘭州7300000

肝細胞癌是肝硬化患者最常見的死亡原因[1]，占全部肝癌的90%以上，嚴重地威脅著人類的健康。慢性肝炎、肝硬化等導致的肝功能受損是肝細胞癌最重要的發(fā)病因素之一。目前，手術切除仍然是肝細胞癌的首選治療方式，但由于潛在的肝功能障礙，手術切除在臨床上并未得到廣泛應用[2]。隨著醫(yī)療技術的進步，肝移植已被用于肝癌的治療，但由于大部分肝癌患者的確診時間較晚，且缺乏肝移植的供體，故僅有約15%的患者能夠受益，從而限制了肝移植治療肝癌的進展[3]，因此化療仍然是肝癌治療的重要方法；但是，由于肝癌細胞對傳統(tǒng)化療藥物產生了一定的耐藥性且傳統(tǒng)化療藥物的毒副作用較大，使化療的應用受到了一定的限制[4]，因此，許多化療藥物增敏劑被發(fā)掘且得到高效利用，藥物的聯(lián)合使用使化療效果得以提高的同時大大地減少了化療藥物的用量，降低了其毒副作用，故而受到臨床治療領域的廣泛推崇。目前，一些增敏劑的作用機制尚未見報道。本課題組將三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）與3'-疊氮-2'，3'-脫氧胸腺核苷（3'-azido-2'，3'-dideoxy thymidine，AZT）聯(lián)合用于肝細胞癌的治療，雖然效果顯著，但是AZT通過何種機制來起到增效的作用仍然未知，對水通道蛋白9（aquaporin 9，AQP9）的研究有望為AZT增敏機制的明確提供新的思路。

1 As 2 O 3聯(lián)合AZT治療肝癌的研究進展

1.1 As 2 O 3治療肝癌的研究進展

As2O3是中藥砒霜的主要成分，為一種劇毒藥物。20世紀70年代中國學者將As2O3作為一線藥物用于急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）的治療[5]，同時也有報道顯示As2O3對肝癌、宮頸癌、肺癌等有顯著的療效[6-7]。另有研究表明，As2O3可抑制肝癌細胞的增殖，誘導肝癌細胞的凋亡，并抑制肝癌細胞的侵襲和轉移[8-10]。然而As2O3的毒副作用卻限制了其在臨床上的廣泛應用，除產生惡心、嘔吐等應激反應外，As2O3還可引起心臟毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性及骨髓抑制等多個器官系統(tǒng)病變[11-12]。因此，在不影響療效的情況下降低As2O3的用量，尋找其減毒增效的聯(lián)合用藥方案，從而增強肝癌細胞對As2O3的敏感性已成為肝癌治療的研究重點。

1.2 AZT用于肝癌治療的研究進展

AZT為胸苷類似物，也稱疊氮胸苷，是一種端粒酶抑制藥，可在腫瘤細胞的端粒復制時摻入新合成的端粒DNA鏈而使端粒復制終止，進而起到抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的作用[13]。Sabokrouh等[14]研究表明，Pt-AZT通過抑制端粒酶的活性，下調Bcl-2的表達，從而抑制小鼠肝癌細胞的增殖。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，AZT與大黃素聯(lián)合使用可協(xié)同抑制白血病KG-1a細胞的增殖。AZT還可以與放療藥物聯(lián)合應用于腦膠質瘤和宮頸癌的治療中，通過增強射線對癌細胞的殺傷力而發(fā)揮其增敏作用[16-17]。Chau等[18]將阿扎胞苷與As2O3聯(lián)合起來用于白血病的治療，實驗證明AZT能夠促進白血病細胞對As2O3的吸收，增強其對As2O3的敏感性。AZT與阿扎胞苷同為核苷類藥物，具有相似的結構及功能。因此，本實驗組推測：AZT是一種非常有潛力的抗癌藥物，與As2O3聯(lián)合使用可能達到肝癌治療的目的，并有望起到增效減毒的作用，并首次提出將AZT作為增敏藥物與As2O3聯(lián)合應用于肝細胞癌的治療。

基于上述設想，本實驗組開展相關研究，前期實驗結果表明As2O3聯(lián)合AZT可協(xié)同抑制人肝癌HepG2細胞的增殖，這一作用可能與誘導肝癌細胞凋亡、上調caspase 3和BAX表達以及下調BCL-2表達有關[9]；As2O3聯(lián)合AZT能夠明顯抑制人肝癌HepG2細胞的遷移和侵襲能力，該抑制作用可能是通過調控ERK1/2信號通路的磷酸化以及下調MMP-2和VEGF的表達來實現(xiàn)的[10]。上述研究成果證明，將As2O3與AZT聯(lián)合應用可抑制人肝癌HepG2細胞的增殖、侵襲、轉移，并促進其凋亡，且AZT可有效減少As2O3的使用劑量，但該過程是否是通過AZT促進HepG2細胞對As2O3的攝取來實現(xiàn)的尚不清楚。

2 AQP 9的結構、分布及功能

2.1 AQP 9的結構與分布

AQP9與其他水通道蛋白的結構基本類似，是一種跨細胞膜6次的單肽鏈，每個單肽鏈均為由295個氨基酸組成的單體，其相對分子質量約為31 kD，肽鏈的羧基端與氨基端均位于細胞內，共形成7個環(huán)，3個胞內環(huán)，4個胞外環(huán)[19]。AQP9的高級結構由同源四聚體構成，6個跨膜的α螺旋組成一個單體，該α螺旋構成了基本的含水通道，故AQP9具備通透水的作用[20]。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)，AQP9主要表達于肝臟組織和脂肪組織，其中AQP9在肝臟中的表達最為豐富，主要分布于面向門靜脈的肝竇狀隙質膜上，是肝臟最重要的水甘油通道。

2.2 AQP 9的功能

AQP9作為一種水通道蛋白，除了可以轉運水以外還可以對甘油、氨、尿素、嘌呤及嘧啶等進行跨膜轉運。Qiu等[22]實驗表明，AQP9還參與了機體糖代謝、脂代謝、膽汁的分泌以及砷的代謝等；Loitto等[23]也報道，AQP9的高表達能夠增加水分子的跨膜流動，從而迅速改變細胞內外滲透壓，導致細胞發(fā)生形態(tài)學改變，形成偽足，該偽足可促使腫瘤細胞脫離原位而發(fā)生遠處轉移，因此AQP9參與了腫瘤的遷移過程。上述研究表明，AQP9參與了肝臟的眾多生理和病理過程，在維持肝臟的正常生理功能及參與其病理環(huán)節(jié)中起著重要的作用。

3 AQP 9與肝癌的關系

既往有研究表明，與正常肝臟組織相比，AQP9在肝癌組織中呈現(xiàn)低表達，冉呂[24]研究發(fā)現(xiàn)，AQP9 mRNA和AQP9蛋白在肝癌組織中的表達比在癌旁組織中明顯下降，對其做相關性分析表明，AQP9表達的下降程度與肝癌的轉移程度呈正相關。Blum和Spangenberg[25]分析，正是由于AQP9的表達水平較低，才導致癌細胞對凋亡的抵抗性增強，從而惡性程度也就更高。Jablonski等[26]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中AQP9的表達水平相比于癌旁組織明顯下降。Padma等[27]研究進一步表明，AQP9在肝臟正常組織中以肝中央靜脈為中心呈帶狀分布樣表達，但是在肝癌組織中其表達明顯減少，進而推測AQP9在病理組織上表達的改變可能是源于肝細胞癌的特征性改變。除此之外，張文廣等[28]報道，AQP9可能直接參與肝癌細胞的凋亡，進而影響肝癌的預后，用Hg2+選擇性抑制水通道AQP9，發(fā)現(xiàn)引起肝細胞因滲透壓改變所致的水通透是AQP9依賴性的，且該水通透直接與細胞的凋亡速度相關，抑制該通透可抑制凋亡小體的形成，相反的，AQP9過表達可增加肝癌細胞對水的通透作用，促進肝癌細胞凋亡。以上結果均表明，AQP9的表達水平可能直接影響著原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預后。

4 AQP 9在As 2 O 3聯(lián)合AZT治療肝癌中的作用

前期研究表明，As2O3的轉運吸收及釋放是通過芳基硫酸脂酶A、B，砷抵抗蛋白3，ATP結合盒式轉運蛋白等完成的。但是，近期研究顯示，As2O3還可通過AQP9出入細胞[29]，該現(xiàn)象可能是因為三價砷與甘油具有較相似的結構及電荷分布，因此可模仿甘油通過水-甘油通道AQP9進入細胞[30]。Liu等[31]研究表明，AQP9主要表達于肝臟組織及脂肪組織，是亞砷酸鹽最高效的吸收通道。Mukhopadhyay等[32]研究發(fā)現(xiàn)，早幼粒細胞白血病HL60細胞系被過表達AQP9后，細胞對As2O3的敏感性增強。Leung等[33]對10個髓系和淋巴系白血病細胞株分別應用RT-qPCR和Western blotting的方法檢測AQP9 mRNA及蛋白的表達量，結果表明：AQP9的表達量與As2O3誘導的細胞毒性呈正相關，在此基礎上，進一步選擇既不表達AQP9且對As2O3不敏感的Hep3B肝癌細胞株，轉染EGFP-AQP9到該細胞株，上調AQP9的表達后發(fā)現(xiàn)，As2O3誘導的細胞毒性也相應增加了。利用同樣的方法上調K562慢性粒細胞白血病細胞株中的AQP9表達后發(fā)現(xiàn)，該細胞內的As2O3濃度及其誘導的細胞毒性也隨之顯著增加，因此，可得出結論，即AQP9調控As2O3的轉運及白血病細胞對As2O3的敏感性。Tang等[34]在肝癌HepG2細胞中導入AQP9過表達重組質粒，發(fā)現(xiàn)AQP9表達量增高時，可提高As2O3對肝癌細胞的增殖抑制作用，促進caspase 3的活化以促進細胞凋亡，并抑制細胞的遷移和侵襲。以上結果與本課題組通過As2O3與AZT聯(lián)合用藥對肝癌HepG2細胞產生的生物學行為相吻合。

綜上所述，在As2O3與AZT聯(lián)合治療肝癌的過程中，AZT扮演著As2O3增敏劑的重要角色，其在協(xié)同抑制人肝癌HepG2細胞的增殖、侵襲、轉移及促進人肝癌HepG2細胞凋亡的基礎上大大地減少了As2O3的使用劑量，起到了減毒增效的作用。AZT的As2O3增敏作用可能與其影響AQP9的表達有關，其可能通過上調AQP9的表達增加肝癌細胞對As2O3的敏感性，從而促進As2O3的吸收，提高As2O3的利用效率。

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