藜麥總皂苷含量測(cè)定方法的比較

熊成文，李曉偉，徐得娟

（1.青海省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院，青海西寧810016；2.青海高遠(yuǎn)錦禾生態(tài)農(nóng)牧科技有限公司，青海西寧810016）

研究表明許多藜麥中的皂苷類成分具有多種藥理活性[1]，包括鎮(zhèn)痛、抗炎、抗微生物、抗氧化、抗病毒[2]和抗細(xì)胞毒性，影響礦物質(zhì)、維生素的吸收和動(dòng)物生長(zhǎng)，具有溶血和增強(qiáng)免疫的作用，還有增加腸黏膜滲透性，保護(hù)神經(jīng)，以及降低脂肪吸收等作用[3-5]。據(jù)報(bào)道藜麥皂苷抗真菌時(shí)，單體皂苷的活性很小或基本沒(méi)有活性，而藜麥總皂苷在50μg/mL時(shí)可有效抑制白色念珠菌，說(shuō)明不同皂苷之間具有協(xié)同作用[6]。藜麥皂苷具有殺螺活性[7]，還可以作為黏膜疫苗注射的助劑[8]，藜麥皂苷的構(gòu)效關(guān)系的研究結(jié)果表明的五環(huán)骨架可提高藥物的選擇性[9]，因此，藜麥皂苷為治療和化療藥物的開(kāi)發(fā)提供了更為豐富的資源，藜麥皂苷作為藥物也有更為廣泛的應(yīng)用前景。

建立一種可靠、準(zhǔn)確的藜麥皂苷含量測(cè)定方法，可為藜麥皂苷廣泛用于藥品、化妝品、食品添加劑等行業(yè)提供有利的評(píng)價(jià)手段，同時(shí)也可為藜麥的加工工藝水平提供參考。本文嘗試通過(guò)試驗(yàn)比較兩種藜麥皂苷對(duì)照品含量方法檢測(cè)結(jié)果的差異，并對(duì)不同藜麥加工方法處理后的藜麥中皂苷的殘留情況進(jìn)行了考察，可為以后大規(guī)模提取利用藜麥皂苷打下一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

藜麥為青藜一號(hào)產(chǎn)自青海省海西蒙古族藏族自治州都蘭縣，平均海拔3 100m；齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)110709-200505）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；藜麥皂苷A對(duì)照品：青海高遠(yuǎn)錦禾生態(tài)農(nóng)牧科技有限公司制備；香草醛、乙醇、甲醇、冰醋酸、高氯酸：均為分析純；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 儀器設(shè)備

Lambda35紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)PE公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司；101-1S電熱鼓風(fēng)干燥箱：邦西儀器科技（上海）有限公司；FA2004電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；JP-030S超聲波清洗機(jī)：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHA-C水浴恒溫振蕩器：上海華鄰實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

藜麥籽實(shí)中的皂苷為三萜皂苷[10]，以往在沒(méi)有藜麥皂苷對(duì)照品的情況下通常選用齊墩果酸為對(duì)照品[11-12]，但藜麥皂苷的分子量因含有糖苷配基一般在700以上，而齊墩果酸不含糖苷配基分子量為456.71，故分別使用藜麥皂苷A和齊墩果酸作為對(duì)照品進(jìn)行比較。藜麥皂苷A分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，分子量810.44。

圖1 藜麥皂苷A分子結(jié)構(gòu)Fig.1 M olecular structureof quinoa saponinsA

準(zhǔn)確稱取齊墩果酸對(duì)照品10.1mg，置50mL量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成0.202mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

準(zhǔn)確稱取藜麥皂苷A對(duì)照品6.60mg，置25mL量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成0.264mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密量取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各0、50、100、200、400μL和藜麥皂苷A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各0、400、600、800、1 000、1 200 μL 置于干燥的具塞試管中，60℃蒸干，取出放冷，依次加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，搖勻，于60℃水浴中保溫15min，取出，用冰水浴冷卻10min，加入4mL冰醋酸，搖勻。選取齊墩果酸400μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液和藜麥皂苷A 400μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于400 nm～760 nm范圍進(jìn)行掃描，選定最大吸收波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A，以吸光度A為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)對(duì)照品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 供試品溶液的制備

1.3.3.1 以齊墩果酸為對(duì)照品的方法

將一定量的藜麥種子粉碎成藜麥粉，分別稱取藜麥粉6份，每份5 g，置于錐形瓶中，按料液比1∶30（g/mL）加入70%乙醇溶液，50℃振蕩提取24 h，抽濾得到濾液即為供試品溶液。

吸取供試品溶液400μL，采用與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的方法測(cè)定其吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出測(cè)定樣品中皂苷的質(zhì)量（m），按照公式求出藜麥中總皂苷的含量。

式中：m為供試液樣品中總皂苷質(zhì)量，mg；V為供試液總體積，mL；M為藜麥總質(zhì)量，g；v為供試液取樣體積，mL。

1.3.3.2 以藜麥皂苷A為對(duì)照品的方法

分別稱取粉碎好過(guò)60目篩的藜麥粉6份，每份1 g，置于100mL錐形瓶中，加入60%乙醇溶液30mL，超聲提取30min，4 000 r/min離心5min，取上清液，殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并上清液回收乙醇至無(wú)醇味，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次10mL，合并萃取液，揮干溶劑，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液400μL，置于具塞試管中，60℃蒸干，取出放冷，采取與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的方法測(cè)定其吸光度A。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得供試品溶液中總皂苷的濃度（mg/mL），按照公式計(jì)算出藜麥中總皂苷的含量。

式中：C為供試品溶液中總皂苷的濃度，mg/mL；V為供試品溶液的總體積，mL；W為藜麥重量，g。

1.3.4 不同測(cè)定方法含量測(cè)定結(jié)果的比較

分別按文獻(xiàn)報(bào)道方法和本次試驗(yàn)采用的方法稱取粉碎好的藜麥粉各6份，測(cè)定其藜麥總皂苷的含量，比較兩種方法測(cè)定的差異。

1.3.5 不同加工工藝去除藜麥皂苷

由于藜麥皂苷是一種抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)[13-14]，并且具有苦澀的味道，因此食用前需盡可能除去[15]。藜麥籽實(shí)中的皂苷主要來(lái)源于殼中，脫殼會(huì)去除大量皂苷，通常采用濕法、干法和混合法去除藜麥籽實(shí)中的皂苷。濕法需要使用大量的水洗滌[16]，水質(zhì)污染問(wèn)題是其主要的問(wèn)題。干法是使用機(jī)器碾磨籽實(shí)去除藜麥皂苷，一般干法更為經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、無(wú)污染，但效果較差，僅能去除80%的皂苷[17]，一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也會(huì)流失。混合法先快速碾磨籽實(shí)，然后簡(jiǎn)單沖洗，避免了營(yíng)養(yǎng)的流失也降低了水中皂苷的含量。通過(guò)對(duì)濕法和混合法處理后藜麥籽實(shí)中皂苷含量的測(cè)定，確定最佳的加工工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的測(cè)定

有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，齊墩果酸采用的檢測(cè)波長(zhǎng)為560nm，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外光譜圖見(jiàn)圖2。由圖2可知，紫外光譜圖中齊墩果酸對(duì)照品在400 nm～760 nm處的最大吸收波長(zhǎng)為545 nm，因此，選用545 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，藜麥皂苷A標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外光譜圖見(jiàn)圖3。由圖3可知，藜麥皂苷A對(duì)照品在400 nm～760 nm處的最大吸收波長(zhǎng)為482 nm，因此，選用482 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外光譜圖Fig.2 Ultraviolet spectrum of oleanolic acid

圖3 藜麥皂苷A標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外光譜圖Fig.3 Ultraviolet spectrum of quinoa saponins A

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)數(shù)據(jù)處理得到的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程為：A=48.171C，r=0.997 2，在 0.004 04 mg/mL～0.040 4mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

通過(guò)數(shù)據(jù)處理得到的藜麥皂苷A標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程為：A=11.811C，r=0.995 1，在 0.021 12mg/mL～0.063 36mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 不同方法含量測(cè)定結(jié)果的比較情況

不同方法藜麥皂苷含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同方法藜麥皂苷含量測(cè)定結(jié)果Table1 The resultof determ ination of quinoa saponin by diferentmethods

采用t檢驗(yàn)，計(jì)算得t值為66.653，查t檢驗(yàn)臨界值表得 t0.05，10=2.228，t＞t0.05，10，說(shuō)明兩種方法測(cè)得的含量均值存在顯著性差異。

2.4 不同加工工藝去除藜麥皂苷效果

藜麥籽實(shí)經(jīng)不同加工工藝后總皂苷含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 藜麥籽實(shí)經(jīng)不同加工工藝后總皂苷含量測(cè)定結(jié)果Table2 The resultof determ ination of totalsaponin in quinoa after different processing

從表2可以看出，碾磨加工后藜麥籽實(shí)中皂苷的量減少了一半，隨著水洗次數(shù)的增加皂苷的量也不再明顯減少，說(shuō)明皂苷主要集中在籽實(shí)的外殼中，通過(guò)碾磨能有效的去除皂苷。單純水洗也能夠去除藜麥中的皂苷，隨著清洗次數(shù)的增加，皂苷的量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，當(dāng)清洗2次后皂苷的量不再明顯降低，清洗2次就可以除去大部分皂苷。對(duì)碾磨后分離得到的種皮粉末中的皂苷含量進(jìn)行檢測(cè)，平均含量為100.35mg/g，是未加工藜麥籽實(shí)中皂苷含量的4倍。

3 結(jié)論與討論

藜麥皂苷味苦，是藜麥中主要的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，在藜麥籽實(shí)中含量較高[18]不利于作為食物和飼料應(yīng)用。同時(shí)皂苷類物質(zhì)具有一定的生物活性[19-21]，可用于藥品[22]、保健食品、化妝品、生物農(nóng)藥、食品添加劑使用[23-24]，因此建立一種簡(jiǎn)便、可靠的藜麥皂苷測(cè)定方法十分必要。采用超聲波提取，香草醛-高氯酸比色法測(cè)定藜麥中皂苷含量，以藜麥皂苷A為對(duì)照品，檢測(cè)波長(zhǎng)482 nm，樣品提取采用60%乙醇溶液，料液比1 ∶30（g/mL），提取時(shí)間 30min，連續(xù)提取 2 次的方法能夠測(cè)得藜麥中總皂苷含量。

濕法去除藜麥籽實(shí)中的皂苷效果較好，能最大程度的去除皂苷，但水質(zhì)污染是其存在的主要問(wèn)題，并不適用于大規(guī)模生產(chǎn)的應(yīng)用?；旌戏ㄈコ见溩褜?shí)中的皂苷，通過(guò)碾磨步驟就能夠去除大部分的皂苷，只需通過(guò)一次水洗就能夠去除籽實(shí)表面殘留的種皮粉末，適合大規(guī)模生產(chǎn)的應(yīng)用。

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