動(dòng)物源性食品中性激素檢測(cè)方法的比較分析

周秋玲，婁婷婷，王素英，張宏宇，*

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；2.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

動(dòng)物源性食品包括可食用的動(dòng)物組織及其高附加值的附屬產(chǎn)物，是日常膳食的重要組成部分。在規(guī)模效益和速度效率的催生下，獲得動(dòng)物源性食品的自然周期被打破。激素可以有效降低成本，改善產(chǎn)品性狀。為了縮短飼養(yǎng)動(dòng)物的生長(zhǎng)和繁殖周期、提高飼料轉(zhuǎn)化率、改善動(dòng)物源性食品性狀以及降低成本，多種人工激素在飼料中被無節(jié)制的使用，雖然動(dòng)物源性食品產(chǎn)量大增，但是嚴(yán)重的激素殘留問題直接影響著人類的安全[1]。特別是目前使用最多的性激素，對(duì)人類健康危害極大，控制和禁止激素在養(yǎng)殖業(yè)中的使用及相關(guān)法律法規(guī)的建設(shè)已引起各方面的關(guān)注[2]。

近年來，食品安全事件屢見報(bào)端，性激素殘留的動(dòng)物源性食品更使消費(fèi)者談虎色變。所以，動(dòng)物源性食品的安全已引起全社會(huì)的廣泛關(guān)注。從20世紀(jì)80年代開始，美國(guó)和日本等國(guó)家或組織就致力于通過立法禁止或限制在性激素類藥物在食用性動(dòng)物飼養(yǎng)中的使用[3-8]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部176號(hào)公告明確規(guī)定，禁止飼料和動(dòng)物飲用水中添加己烯雌酚、雌二醇等雌性激素，炔諾醇、左炔諾孕酮、炔諾酮等孕激素，并在235號(hào)公告規(guī)定了己烯雌酚、醋酸甲羥孕酮、甲基睪丸酮、群勃龍、玉米赤霉醇等外源性激素物質(zhì)在動(dòng)物性食品中的最高殘留限量為不得檢出[9-10]。盡管如此，由于商業(yè)利益驅(qū)動(dòng)，這些禁藥依然不斷地通過動(dòng)物源性食品進(jìn)入體內(nèi)，最終會(huì)對(duì)人類的健康產(chǎn)生不利的影響。因此，探討和開發(fā)動(dòng)物源性食品中性激素的檢測(cè)方法，對(duì)于食品安全的綜合管理，有效保障食品安全具有重要的指導(dǎo)意義。

1 動(dòng)物源性食品中性激素的來源

性激素是由動(dòng)物性腺分泌或人工合成的一類甾體激素的總稱，分子量低，親脂性強(qiáng)，對(duì)動(dòng)物體的生理及代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。性激素大都具有甾族化合物的母核結(jié)構(gòu)，包括雌激素（雌二醇、雌三醇、雌酮）、孕激素（孕酮、甲羥孕酮、美侖孕酮）和雄激素（脫氫表雄酮、硫酸脫氫表雄酮、二氫睪酮、甲睪酮、美雄酮、去甲雄三烯醇酮、去氫睪酮、去甲睪酮、脫氫表雄酮、雄烯二酮和表睪酮以及人工合成的酯化、甲氧基化或氟取代的衍生物）三大類[11-12]。根據(jù)來源和化學(xué)結(jié)構(gòu)，性激素可分為人工合成類固醇激素（丙酸睪酮、甲烯雌醇、苯甲酸雌二醇、醋酸群勃龍等）、人工合成的非類固醇激素（己烯雌酚、己烷雌酚等）、內(nèi)源性性激素（睪酮、孕酮、雌酮、17β-雌二醇）三大類[3]。

由于性激素在預(yù)防和治療家畜疾病方面具有顯著效果，且可以促進(jìn)其生長(zhǎng)、泌乳以及肌肉脂肪的分配，因此性激素會(huì)被用來育肥家畜，但是，通過口服或注射的性激素會(huì)殘留于動(dòng)物體內(nèi)而污染其制品[13-14]。

2 動(dòng)物源性食品中性激素殘留的危害及相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

性激素穩(wěn)定性較高，正常的烹調(diào)加工均不能將其破壞，可通過食物鏈進(jìn)入人體，在人體內(nèi)積累的量超過人體正常水平時(shí)，就會(huì)破壞機(jī)體的正常生理平衡，從而產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)，其中以甲基睪酮、己烯雌酚和雌二醇較為典型。所以，大部分國(guó)家禁止性激素用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，不允許在食品中檢出，我國(guó)現(xiàn)行的動(dòng)物源性食品中性激素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 我國(guó)現(xiàn)行的動(dòng)物源性食品中性激素檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)Table1 The standardsof detectionmethods for gonadalhormones in anim alderived food in China

甲基睪酮是由人工合成的性激素，由于其具有提

高產(chǎn)量和控制性別等作用，所以在動(dòng)物養(yǎng)殖中被大量使用。但是，其在動(dòng)物體內(nèi)的代謝緩慢，即使極小的殘留會(huì)對(duì)人類健康造成巨大的潛在危害，包括美國(guó)、歐盟、日本等多個(gè)國(guó)家及組織已限制或禁止水產(chǎn)品中使用此激素并已立法[15]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002年實(shí)施的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY5070-2002《無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》中明確規(guī)定不允許使用甲基睪酮等激素類藥物，2003年農(nóng)業(yè)部發(fā)布的235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中也規(guī)定其為禁止使用獸藥，在所有動(dòng)物可食組織中不得檢出。

己烯雌酚具有促進(jìn)蛋白合成，加快動(dòng)物增重和骨骼鈣化的作用，可作為牛、羊的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，減少飼料的使用量[16]。但是，己烯雌酚會(huì)殘留于動(dòng)物源食品中，其不但會(huì)擾亂激素平衡，更嚴(yán)重的還會(huì)誘發(fā)女性乳腺癌、卵巢癌等疾病，農(nóng)業(yè)部已明確規(guī)定禁止使用該性激素[17]。

雌二醇不但具有加速動(dòng)物生長(zhǎng)、繁殖的作用，而且可以提高畜禽瘦肉比例，在養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[18]。但是雌二醇會(huì)在動(dòng)物源食品中形成殘留，長(zhǎng)期食用還會(huì)造成不育癥、女性早熟、男性女性化、男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常，使女性乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病率上升[19]。為此，早在1991年，美國(guó)已明確規(guī)定了雌二醇棕櫚酸在家禽的可食用部分的最高殘留限量為0.002mg/kg，而韓國(guó)規(guī)定牛肉中苯甲酸雌二醇最高限量是0.000 12mg/kg，歐盟早在1996年已立法并禁止該類性激素在食品動(dòng)物養(yǎng)殖中使用，在我國(guó)，包括苯甲酸雌二醇等19種性激素及其鹽、酯等也禁止在食品動(dòng)物養(yǎng)殖中使用[20]。

3 動(dòng)物源性食品中性激素殘留的檢測(cè)研究進(jìn)展

由于動(dòng)物或動(dòng)物源性食品基質(zhì)具有一定的復(fù)雜性，性激素種類的多樣性以及低檢出水平的要求，而且樣品提取和凈化的過程比較復(fù)雜，導(dǎo)致回收率不高，使得性激素多殘留分析檢測(cè)具有一定的難度[21-23]。因此，如何對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理以富集、凈化待測(cè)組分并消除基體干擾，同時(shí)保證預(yù)處理過程中目標(biāo)物性激素的損失最小，是一個(gè)必須解決的問題。另一方面要利用高靈敏度和高選擇性的檢測(cè)分析技術(shù)，盡量降低檢測(cè)限。

3.1 樣品的提取及凈化

動(dòng)物源性食品中部分激素以水溶性較強(qiáng)的結(jié)合物形式存在。為了使其能溶于有機(jī)溶劑，需對(duì)樣品進(jìn)行粉碎、冷凍干燥和均質(zhì)化，通過酶解將結(jié)合態(tài)的性激素解離出來，然后用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取和富集[24]。為了獲得更加純凈的待分析物，動(dòng)物組織中性激素的提取溶劑包括甲醇、乙腈、二乙醚、叔丁基甲醚、水-甲醇、水-丙酮、乙腈-偏磷酸、氯仿-甲醇等[25]?？刹捎靡阂狠腿　⒐滔辔⑤腿?、超臨界流體萃取、冷凍離心除脂、加壓液體萃取等多種方法進(jìn)行凈化處理，進(jìn)一步方便目標(biāo)性激素的檢測(cè)[26-29]。凈化的目的是去除生物基質(zhì)中的脂肪、蛋白等雜質(zhì)，從而降低干擾，提高分析靈敏度。為了達(dá)到更好的純化效果，也可將幾種方法或柱子結(jié)合使用。動(dòng)物源性食品中幾種常見凈化方法優(yōu)劣比較見表2。

3.2 動(dòng)物源性食品中性激素的檢測(cè)和評(píng)價(jià)方法的比較

根據(jù)國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的規(guī)定，又因食品基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜，獸藥殘留量極低，因此對(duì)獸藥殘留的檢測(cè)方法、靈敏度等均有較高要求。分析檢測(cè)食品基質(zhì)中性激素的傳統(tǒng)方法有紫外分光光度法、熒光光度法、酶聯(lián)免疫法（Enzyme linked immunosorbentassays，ELISA）、薄層色譜法、氣相色譜法（Gas chromatography，GC）、液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS/MS）等，具體信息及其在應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn)見表3。

表3 動(dòng)物源性食品中性激素檢測(cè)方法的比較Table3 Comparison of theadvantagesand disadvantagesof the detectionmethodsofanimalderived food

4 色譜-質(zhì)譜法在動(dòng)物源性食品性激素檢測(cè)中的研究進(jìn)展

4.1 氣相色譜—質(zhì)譜法

氣相色譜—質(zhì)譜法包括氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）。氣相色譜—質(zhì)譜法集聚了色譜的高效分離及質(zhì)譜在檢測(cè)和確認(rèn)化合物的優(yōu)點(diǎn)，氣相色譜—質(zhì)譜法成為性激素檢測(cè)分析中常用的技術(shù)。氣相色譜—質(zhì)譜法的靈敏度、準(zhǔn)確度、回收率均較好，分析過程簡(jiǎn)便快捷，適用于同時(shí)檢測(cè)性激素多組分殘留。但是，性激素對(duì)熱不穩(wěn)定且不易揮發(fā)，用氣相色譜—質(zhì)譜法分析，首先要用硅烷化試劑和?；噭⑿约に匮苌?，獲得熱穩(wěn)定性及揮發(fā)性都較好的衍生化物質(zhì)。

黃冬梅等[30]將雌二醇D2作為內(nèi)標(biāo)定量，通過GCMS建立了水產(chǎn)品中雌二醇?xì)埩袅康臋z測(cè)方法，采用葡糖苷酸酶酶解樣品，正己烷去除脂肪和色素等雜質(zhì)，用乙酸乙酯提取，濃縮后衍生化，然后進(jìn)行檢測(cè)。鄒龍等[31]以氘代同位素為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定了不同魚貝類肌肉組織中雌二醇?xì)埩袅?。首先在樣品中加入?nèi)標(biāo)和乙酸鈉緩沖溶液并均質(zhì)，然后用乙腈多次超聲提取，利用正己烷脫脂除雜質(zhì)，利用C18固相萃取柱凈化和柱前三甲基硅烷化后，進(jìn)行GC-MS分析。根據(jù)雌二醇和內(nèi)標(biāo)衍生物定量離子質(zhì)量色譜圖的峰面積比值，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，最低定量檢測(cè)限為2μg/kg。曾東平等[32]采用固相萃取小柱凈化衍生后，利用GC－MS對(duì)豬肌肉中甲睪酮等多種性激素殘留進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)濃度為2.5μg/kg～50μg/kg時(shí)，其線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)均大于0.97，回收率和靈敏度較好，可在水產(chǎn)品性激素殘留檢測(cè)中大力推廣。宮向紅等[33]用乙酸乙酯對(duì)鰻魚和蝦中性激素己烯雌酚進(jìn)行提取，正相固相萃取小柱凈化、衍生后進(jìn)行GC-MS分析，當(dāng)添加水平在0.5μg/kg～1.0μg/kg時(shí)，回收率大于75%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～2.7%，線性相關(guān)系數(shù)為0.999。

湛嘉等[34-35]采用GC-MS分別對(duì)黃鱔和豬肉中的性激素殘留開展了檢測(cè)，采用葡糖苷酸酶對(duì)黃鱔提取物進(jìn)行水解，用叔丁基甲醚提取，用正己烷脫脂，再經(jīng)C18小柱和NH2小柱凈化，用七氟丁酸酐進(jìn)行衍生化，基于外標(biāo)法，利用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)，檢出限在0.50μg/kg～1.00μg/kg，平均回收率范圍為56%～103%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為3.1%～29.5%，且對(duì)不同批次樣品的重復(fù)性也較好；對(duì)豬肉中l(wèi)6種性激素多殘留檢測(cè)結(jié)果顯示，檢出限在0.25μg/kg～1.0μg/kg之間，平均回收率分別為83.7%～107.9%，重復(fù)性好。

Scarth等[36]利用GC-MS/MS測(cè)雄性激素和孕激素，檢測(cè)限為 10.9 pg/mL～160.7 pg/mL。Rambaud 等[37]采用GC-MS/MS同時(shí)測(cè)定了動(dòng)物毛發(fā)中的28種同化激素，用甲醇提取基質(zhì)中的藥物，分別得到雌性激素與雄性激素和孕激素，檢測(cè)限為0.1μg/kg～10μg/kg。

但是，氣相色譜法要求分析物有較低的沸點(diǎn)和很好的揮發(fā)性，由于激素個(gè)體性質(zhì)的差異常需要對(duì)其進(jìn)行多種衍生處理，雖然氣相色譜分析法也能實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的定性和確證分析，但需要衍生處理而太耗時(shí)，不能滿足快速分析的需要，有的激素也不容易通過衍生得到很好的極性和熱穩(wěn)定性，制約了其在多殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。

4.2 液相色譜—質(zhì)譜法

高效液相色譜法以液體作為流動(dòng)相，可同時(shí)檢測(cè)多種類固醇激素，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，不需要衍生化，只要適當(dāng)應(yīng)用各種試劑及凈化方法，再結(jié)合一定的檢測(cè)器，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種物質(zhì)的檢測(cè)分析。液相色譜-質(zhì)譜法包括高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）和超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS），目前液相色譜－質(zhì)譜法是分析食品中性激素多組分殘留的有效方法之一。

楊敏等[38]通過高效液相色譜法對(duì)魚、蝦中己烯雌酚殘留進(jìn)行定量檢測(cè)，最低檢測(cè)限為2.5μg/kg，其回收率和線性關(guān)系良好。周建科等[39]采用高效液相色譜法成功建立了中老年奶粉中性激素的監(jiān)測(cè)分析方法。Yang等[40]經(jīng)Helix pomatia水解，甲醇提取，石墨化碳黑固相萃取，再過NH2柱，利用液相色譜方法檢測(cè)肉、奶、肝臟中50種激素殘留的含量。檢出限達(dá)到0.04 μg/kg～20 μg/kg。

但是，液相色譜的紫外檢測(cè)器存在一定的局限性，如果液相色譜結(jié)合三重四極桿、離子阱、飛行時(shí)間等質(zhì)譜檢測(cè)器，可大大提高準(zhǔn)確度，可實(shí)現(xiàn)多殘留的同時(shí)檢測(cè)分析。高效液相色譜-質(zhì)譜法集高效分離和多組分定性定量于一體，可提供待測(cè)樣品完整的準(zhǔn)分子、離子，如采用超高效液相色譜還可以進(jìn)一步改善樣品的分離度、分析速度和靈敏度。

萬巧玲等[41]利用HPLC-MS/MS定量分析雌酮、17β-雌二醇和17α-乙炔基雌二醇，檢測(cè)限分別為0.5、0.4、0.1 ng/L。Vanhaecke 等[42]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)34種合成類固醇激素（包括10種雌性激素、14種雄性激素、10種促孕激素）在牛肉中的殘留，檢測(cè)限與定量限分別為0.04μg/kg～0.88μg/kg和0.12μg/kg～1.9μg/kg。該方法檢測(cè)到所有的自然的、合成的類固醇，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜20%，線性相關(guān)系數(shù)在0.991～0.999之間。Xu等[43]利用LC/ESIMS/MS檢測(cè)動(dòng)物肌肉中10種激素殘留含量，檢出限達(dá)到 0.06μg/kg～0.22μg/kg，定量限達(dá)到 0.12μg/kg～0.54μg/kg。Blasco等[44]均質(zhì)后經(jīng) SubtilisinA 降解，甲醇提取，過C18和NH2柱，乙腈洗脫，對(duì)肉制品中22中激素殘留進(jìn)行了分析，檢出限小于0.5μg/kg。劉桂華等[45]開展了深圳市售豬肉、牛肉、雞蛋和牛奶中激素殘留情況的多組分同時(shí)測(cè)定，用乙腈提取待測(cè)樣品并用正己烷脫脂，然后利用HLB-NH2柱串聯(lián)固相萃取凈化，采用HPLC-MS/MS電噴霧電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量，20種目標(biāo)性激素的方法定量限為0.5μg/kg～1.0μg/kg，方法平均回收率60.4%～118.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.5%～16.2%，該方法可用于豬肉、牛肉、雞蛋和牛奶中20種游離態(tài)性激素的檢測(cè)。

綜上所述，食品基質(zhì)中性激素多殘留檢測(cè)的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)多采用液相色譜-質(zhì)譜法，而且歸因于其較高的準(zhǔn)確性和靈敏度，以液相色譜－質(zhì)譜法來測(cè)定動(dòng)物源性食品中性激素殘留的標(biāo)準(zhǔn)將不斷得到更新。

5 總結(jié)與展望

近幾年來，隨著科技的發(fā)展及生活水平的提高，食品中性激素多組分殘留的檢測(cè)要求越來越高，因此發(fā)展低檢出限高靈敏度的多組分殘留同時(shí)檢測(cè)方法越來越受到重視。目前，主要采用色譜與高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)一質(zhì)譜相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。但是在氣相色譜-質(zhì)譜法使用過程中，很難做到一種衍生試劑可以將所有的性激素進(jìn)行衍生，限制了多殘留的同時(shí)檢測(cè)；而且在衍生化過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物會(huì)對(duì)目標(biāo)待測(cè)物產(chǎn)生干擾，使檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度降低。而采用液相色譜—質(zhì)譜法適合分析熱穩(wěn)定性和熱揮發(fā)性差的化合物，可避免上述問題，而且隨著多種質(zhì)譜檢測(cè)器的應(yīng)用，還可以確定一些未知激素進(jìn)行定性和定量分析。

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