前列腺癌細胞miR-191-5p表達變化及其對細胞增殖和凋亡的影響

張沖，楊鵬，劉振湘，呂蔡

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院，?？?70208)

微小RNA(miRNA)是一類長度為20～24個核苷酸的非編碼小分子RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平通過促進靶mRNA降解或抑制其翻譯而發(fā)揮負性調(diào)控作用。大量研究表明，miRNA作為關(guān)鍵調(diào)控分子，可通過調(diào)控腫瘤細胞的多種生物學(xué)過程參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展[1]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-191-5p作為原癌基因，在肝癌、腎細胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中表達上調(diào)，可通過調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡等發(fā)揮促癌作用[2～7]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-191-5p在前列腺癌組織中表達上調(diào)[8,9]，但其在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用鮮見報道。2016年3～12月，本研究觀察了miR-191-5p在不同前列腺癌細胞中的表達變化及miR-191-5p敲低對前列腺癌細胞PC-3增殖和凋亡的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌細胞PC-3、LNCap、DU145和正常前列腺上皮細胞RWPE-1均購自中國科學(xué)院上海細胞庫。miR-191-5p inhibitor及 NC inhibitor均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；RNA提取試劑TRIzol和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAi max均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit和實時熒光定量PCR SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒均購自日本TaKaRa公司；CCK-8試劑和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清及青霉素-鏈霉素雙抗溶液均購自美國Hyclone公司；胰酶購自美國Sigma公司。

1.2 前列腺癌細胞與正常前列腺上皮細胞miR-191-5p表達檢測 采用qRT-PCR法。將人前列腺癌細胞PC-3、LNCap、DU145和正常前列腺上皮細胞RWPE-1接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用TRIzol試劑提取人前列腺癌細胞PC-3、LNCap、DU145和正常前列腺上皮細胞RWPE-1的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit和實時熒光定量PCR SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進行qRT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，miRNA特異引物和通用下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補足至20 μL。PCR反應(yīng)采用兩步法：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火延伸30 s共40個循環(huán)。miR-191-5p特異引物：5′-CAACGGAATCCCAAAAGCAGCTG-3′，以U6為內(nèi)參，使用ABI7500 Fast 進行qRT-PCR反應(yīng)和數(shù)據(jù)收集。采用2-ΔΔCt法計算各細胞中miR-191-5p相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3 miR-191-5p敲低及其對PC-3細胞增殖、細胞周期比例、細胞凋亡影響的觀察

1.3.1 miR-191-5p敲低 將PC-3細胞接種于6孔板中，每孔1×106個，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過夜。待細胞融合30%～50%時，隨機分為敲低組和對照組，參照Lipofectamine RNAi max試劑說明書分別轉(zhuǎn)染miR-191-5p inhibitor、NC inhibitor。轉(zhuǎn)染48 h，采用qRT-PCR法檢測兩組miR-191-5p相對表達量，具體步驟參照1.2。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 miR-191-5p敲低后細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。兩組轉(zhuǎn)染24 h，收集細胞，加入完全培養(yǎng)液重懸，以3 000個/孔接種于96孔板。兩組各設(shè)置5行，每行5個復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)6、24、48、72、96 h時，加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h。酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測各孔的光密度(OD)值。以O(shè)D450值表示細胞增殖能力。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 miR-191-5p敲低后細胞周期比例觀察 采用流式細胞術(shù)。兩組轉(zhuǎn)染24 h，收集細胞，以1×106個/孔接種于6孔板中，用預(yù)冷的70%乙醇于4 ℃條件下固定過夜，PBS洗滌，用含50 μg/mL碘化丙啶(PI)、100 μg/ mL RNase A和0.2%(v/v)Triton X-100的染色液避光處理30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期，采用FlowJo軟件分析各周期細胞比例。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 miR-191-5p敲低后細胞凋亡能力觀察 采用流式細胞術(shù)。兩組轉(zhuǎn)染24 h，收集細胞，以1×106個/孔接種于6孔板中，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后置于冰上，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測凋亡細胞比例。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌細胞與正常前列腺上皮細胞miR-191-5p表達比較 前列腺癌細胞PC-3、LNCap、DU145和正常前列腺上皮細胞RWPE-1中miR-191-5p相對表達量分別為5.790±0.299、4.550±0.664、2.790±0.145、1.000±0.038，前列腺癌細胞PC-3、LNCap、DU145中miR-191-5p相對表達量均高于正常前列腺上皮細胞RWPE-1(P均<0.01)。

2.2 敲低組與對照組miR-191-5p表達比較 敲低組與對照組miR-191-5p相對表達量分別為0.27±0.09、1.00±0.02，敲低組明顯低于對照組(P<0.01)。

2.3 敲低組與對照組細胞增殖能力比較 敲低組與對照組轉(zhuǎn)染24 h再培養(yǎng)6 h時細胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，敲低組轉(zhuǎn)染24 h再培養(yǎng)24、48、72、96 h時細胞增殖能力均低于對照組(P<0.05或<0.01)。見表1。

表1 敲低組與對照組轉(zhuǎn)染24 h再培養(yǎng)6、24、48、72、96 h細胞增殖能力比較

注：與對照組同時間比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.4 敲低組與對照組細胞周期比例比較 敲低組G0/G1期細胞比例高于對照組，S期細胞比例低于對照組(P<0.05或<0.01)；兩組G2/M期細胞比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 敲低組與對照組細胞周期比例比較

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.5 敲低組與對照組細胞凋亡比例比較 敲低組與對照組細胞凋亡比例分別為(16.67±0.97)%、(9.27±0.85)%，兩組比較P<0.01。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，有多種miRNA在腫瘤組織和腫瘤細胞中異常表達，發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用，作為重要的調(diào)控因子參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10～13]。如miR-191-5p在肝癌、腎細胞癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤細胞中表達升高，并可通過調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡等發(fā)揮促癌作用[2～6]；miR-191-5p可作為肝細胞癌治療的潛在靶點，抑制其表達可降低肝癌細胞的增殖活性并誘導(dǎo)其凋亡，繼而抑制腫瘤生長[2]。肝癌組織中miR-191-5p基因組位點由于處于低甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致miR-191-5p表達升高，進而促進肝癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[3]。腎細胞癌患者血清miR-191-5p表達較健康者明顯升高，提示血清miR-191-5p可作為腎細胞癌早期診斷的潛在標(biāo)志物[4]；miR-191-5p聯(lián)合miR-125b、miR-21用于區(qū)分乳腺癌組織和癌旁正常組織具有較高的敏感性和特異性[5]。miR-191-5p過表達可通過降低caspase 3/7活性和SOX4、p53表達，進而抑制乳腺癌細胞凋亡[14]；miR-191-5p在肝內(nèi)膽管細胞癌組織中表達上調(diào)，且其表達上調(diào)是患者預(yù)后不良的一個獨立危險因素，過表達miR-191-5p可促進肝內(nèi)膽管細胞癌細胞增殖、侵襲與遷移[15]；miR-191-5p可通過作用其靶基因TET1，提高p53基因轉(zhuǎn)錄起始位點的甲基化水平，進而降低p53表達。

Volinia等[9]采用基因芯片技術(shù)對前列腺癌組織及其癌旁正常組織miRNA表達譜進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-191-5p在前列腺癌組織中表達升高。本研究結(jié)果顯示，人前列腺癌細胞PC-3、LNCap、DU145中miR-191-5p相對表達量均高于正常前列腺上皮細胞RWPE-1，表明miR-191-5p可能是前列腺癌發(fā)生的一個原癌基因。本研究利用miR-191-5p inhibitor敲低了PC-3細胞中miR-191-5p表達，并對其細胞增殖、細胞周期及細胞凋亡進行檢測。結(jié)果顯示，敲低miR-191-5p表達能夠抑制PC-3細胞增殖活性，并將其阻滯于G0/G1期，還能誘導(dǎo)PC-3細胞凋亡。說明前列腺癌細胞miR-191-5p高表達與腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，其可能通過調(diào)控細胞增殖和凋亡參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，是一個具有原癌基因作用的miRNA。

綜上所述，miR-191-5p在前列腺癌細胞中表達升高；敲低miR-191-5p表達可抑制前列腺癌細胞增殖并促進其凋亡。

參考文獻：

[1] Kumar B, Lupold SE. MicroRNA expression and function in prostate cancer: a review of current knowledge and opportunities for discovery[J]. Asian J Androl, 2016,18(4):559-567.

[2] Elyakim E, Sitbon E, Faerman A, et al. Hsa-miR-191 is a candidate oncogene target for hepatocellular carcinoma therapy[J]. Cancer Res, 2010,70(20):8077-8087.

[3] He Y, Cui Y, Wang W, et al. Hypomethylation of the hsa-miR-191 locus causes high expression of hsa-mir-191 and promotes the epithelial-to-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma [J]. Neoplasia, 2011,13(9):841-853.

[4] Hauser S, Wulfken L, Holdenrieder S, et al. Analysis of serum microRNAs (miR-26a-2*, miR-191, miR-337-3p and miR-378) as potential biomarkers in renal cell carcinoma[J]. Cancer Epidemiol, 2012,36(4):91-94.

[5] Mar-Aguilar F, Luna-Aguirre CM, Moreno-Rocha JC, et al. Differential expression of miR-21, miR-125b and miR-191 in breast cancer tissue[J]. Asia Pac J Clin Oncol, 2013,9(1):53-59.

[6] Patnaik SK, Kannisto E, Yendamuri S. Overexpression of microRNA miR-30a or miR-191 in A549 lung cancer or BEAS-2B normal lung cell lines does not alter phenotype [J]. PLoS One, 2010,5(2):e9219.

[7] Nagpal N, Kulshreshtha R. miR-191: an emerging player in disease biology[J]. Front Genet, 2014(5):99.

[8] Luu H, Lin H, S?rensen K, et al. miRNAs associated with prostate cancer risk and progression[J]. BMC Urol, 2017,17(1):18.

[9] Volinia S, Calin G, Liu C, et al. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(7):2257-2261.

[10] Grozescu T, Popa F. Prostate cancer between prognosis and adequate/proper therapy [J]. J Med Life, 2017,10(1):5-12.

[11] Rupaimoole R, Slack F. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases[J]. Nat Rev Drug Discov, 2017,16(3):203-222.

[12] Matin F, Jeet V, Clements JA, et al. MicroRNA theranostics in prostate cancer precision medicine[J]. Clin Chem, 2016,62(10):1318-1333.

[13] Kumar B, Lupold SE. MicroRNA expression and function in prostate cancer: a review of current knowledge and opportunities for discovery[J]. Asian J Androl, 2016,18(4):559-567.

[14] Sharma S, Nagpal N, Ghosh PC, et al. P53-miR-191-SOX4 regulatory loop affects apoptosis in breast cancer[J]. RNA, 2017,23(8):1237-1246.

[15] Li H, Zhou ZQ, Yang ZR, et al. MicroRNA-191 acts as a tumor promoter by modulating the TET1-p53 pathway in intrahepatic cholangiocarcinoma [J]. Hepatology, 2017,66(1):136-151.