健脾軟肝方對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝竇基底膜形成的影響

陳文玲，杜良，陳文慧，譚麗萍，姚政，石安華

(1 云南中醫(yī)學(xué)院，昆明650500；2 本溪市第九人民醫(yī)院)

肝纖維化以肝內(nèi)纖維組織生成和降解失平衡，膠原纖維彌漫性增生、沉積，但不形成假小葉結(jié)構(gòu)為特征，是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化必經(jīng)的病理過程[1]。肝纖維化過程中一個(gè)重要的病理改變是纖維間隔近旁肝竇毛細(xì)血管化，而肝竇內(nèi)皮下基底膜形成是肝竇毛細(xì)血管化的重要特征[2,3]。因此推測(cè)，早期阻止肝竇內(nèi)皮下基底膜形成有可能逆轉(zhuǎn)肝纖維化形成，這或許會(huì)成為防治肝硬化的新途徑。健脾軟肝方是云南省名老中醫(yī)蘇漣教授治療肝病的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)肝組織穿刺活檢發(fā)現(xiàn)，該方治療后可延緩肝纖維化形成[4]。但其作用機(jī)制是否與阻止肝竇內(nèi)皮下基底膜形成有關(guān)尚不清楚。2014年5月～2016年3月，本研究觀察了健脾軟肝方對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝竇內(nèi)皮下基底膜形成的影響。現(xiàn)分析結(jié)果并報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠60只，清潔級(jí)，2月齡，體質(zhì)量(150±10)g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供。所有大鼠自由攝食、飲水，于云南中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～22 ℃，相對(duì)濕度50%～55%，通風(fēng)良好。健脾軟肝方，由云南中醫(yī)學(xué)院門診部藥房提供生藥；扶正化瘀膠囊，上海黃海制藥有限責(zé)任公司；CCl4，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。JEM-1011型透射電鏡，日本電子株式會(huì)社；7500fast型PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)BIO公司；Step OneTM型熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司；Image-pro Plus5.0圖像分析系統(tǒng)，日本奧林巴斯株式會(huì)社。兔抗鼠層黏連蛋白(LN)多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；生物素-HRP免疫組化試劑盒(兔)，包括生物素二抗、ABC復(fù)合物，上海生工生物工程股份有限公司。TRIzol試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；SG Fast qPCR Master Mix(High Rox)，美國(guó)BBI公司。

1.2 健脾軟肝方制備 健脾軟肝方方藥組成：蘭花參20 g，三七2 g，莪術(shù)15 g，白芍15 g，香附8 g。用水煎煮，去渣濃縮成稠浸膏狀[5]，4 ℃冰箱冷藏。

1.3 肝纖維化模型制作及分組處理 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、扶正化瘀膠囊組及健脾軟肝方高、中、低劑量組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組制備肝纖維化模型：腹腔注射30%CCl4橄欖油溶液2 mL/kg，每周2次，連續(xù)注射4周。造模同時(shí)，健脾軟肝方高、中、低劑量組根據(jù)人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值分別給予健脾軟肝方10.8、5.4、2.7 g/(kg·d)灌胃，扶正化瘀膠囊組給予扶正化瘀膠囊0.4 g/(kg·d)灌胃。正常對(duì)照組和模型組給予生理鹽水15 mL/(kg·d)灌胃，連續(xù)灌胃4周。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察 末次灌胃結(jié)束，各組禁食12 h、不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速剖腹，取肝組織。選取肝臟質(zhì)地最硬部分，切成1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm大小的多個(gè)組織塊，一部分用10%中性甲醛固定，用于觀察組織病理變化；一部分用3.5%戊二醛固定，用于透射電鏡下觀察肝竇基底膜超微結(jié)構(gòu)；其余部分-80 ℃保存，用于檢測(cè)肝組織ColⅣ、LN表達(dá)。

1.4.1 肝組織病理變化 采用Mallory染色法。取10%中性甲醛固定的肝組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，3 μm厚切片。將切片置于重鉻酸鉀溶液10 min，蒸餾水沖洗2 min；酸性復(fù)紅液染色2 min，蒸餾水稍洗；苯胺藍(lán)溶液染色20 min，95%乙醇快速分化；無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.4.2 肝竇基底膜超微結(jié)構(gòu) 取出3.5%戊二醛固定的肝組織，1%鋨酸再固定，乙醇、丙酮逐級(jí)脫水；然后用環(huán)氧樹脂618滲透、包埋，70 ℃聚合20 h，將組織塊用光鏡定位、修塊，超薄切片機(jī)切片，檸檬酸鉛-醋酸雙氧鈾雙重染色，透射電鏡下觀察。

1.4.3 肝組織ColⅣ、LN mRNA表達(dá) 采用Real-time PCR法。取出冰凍的肝組織，復(fù)溫后根據(jù)TRIzol試劑盒說明提取組織總RNA，按第一鏈cDNA合成試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：ColⅣ上游引物5′-CAGCAATTAGGCAGGTCAAGT-3′，下游引物5′-TGGTGTTTTCACATTCGGTG-3′；LN上游引物5′-CCATGATGACGGCACTTTTC-3′，下游引物5′-GTCAATCCACAGGTAGACGAG-3′；內(nèi)參β-actin上游引物5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物5′-AGCCACCAATCCACACAGAG-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL、Template (cDNA)2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 7 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.4 肝組織LN蛋白表達(dá) 采用ABC法。取出冰凍的肝組織，復(fù)溫后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，3 μm厚切片。切片常規(guī)脫蠟至水，高溫高壓法抗原修復(fù)，3%過氧化氫封閉20 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加兔抗鼠LN多克隆抗體，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗5 min×3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h；PBS沖洗5 min×3次，滴加ABC復(fù)合物室溫孵育2 h；PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封固，光鏡下觀察。LN蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，采用Image-pro Plus5.0軟件分析每個(gè)視野積分光密度值，以其平均值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織病理變化 正常對(duì)照組肝組織可見肝小葉結(jié)構(gòu)完整，僅在匯管區(qū)、中央靜脈周圍有少量膠原纖維沉積。模型組肝組織可見大量呈深藍(lán)色的膠原纖維彌漫性增生、沉積，將正常肝小葉分隔包繞。與模型組相比，扶正化瘀膠囊組及健脾軟肝方高、中、低劑量組肝組織中膠原纖維沉積相對(duì)減少，面積相對(duì)減小，分割包繞程度減輕。

2.2 各組肝竇基底膜超微結(jié)構(gòu)變化 正常對(duì)照組肝竇內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平狀，遠(yuǎn)側(cè)胞質(zhì)有許多不連續(xù)的窗孔，內(nèi)皮下未見基底膜，Disse間隙內(nèi)有少量的膠原纖維沉積。模型組肝竇內(nèi)皮下可見到連續(xù)或不完整的基底膜，Disse間隙內(nèi)可見膠原纖維束。扶正化瘀膠囊組及健脾軟肝方高、中、低劑量組肝竇內(nèi)皮下基底膜不完整，Disse間隙內(nèi)膠原纖維較少，均較模型組有所改善。

2.3 各組ColⅣ mRNA表達(dá)比較 正常對(duì)照組ColⅣ mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.910±0.017，模型組為3.041±0.505，扶正化瘀膠囊組為1.472±0.285，健脾軟肝方高劑量組為2.601±0.270，健脾軟肝方中劑量組為1.836±0.234，健脾軟肝方低劑量組為2.349±0.649。與正常對(duì)照組比較，模型組ColⅣ mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，健脾軟肝方中劑量組和扶正化瘀膠囊組ColⅣ mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，健脾軟肝方高、低劑量組雖然ColⅣ mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。健脾軟肝方高、中、低劑量組間ColⅣ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.4 各組LN mRNA和蛋白表達(dá)比較 見表1。

表1 各組LN mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與扶正化瘀膠囊組比較，△P<0.05；與健脾軟肝方高劑量組比較，▲P<0.05。

3 討論

中醫(yī)并無肝纖維化這一名詞，但類似描述最早記載于《靈樞·水脹篇》“腹脹，身皆大，色蒼黃，腹筋起”。目前中醫(yī)認(rèn)為，肝纖維化屬于“鼓脹”“積聚”“朦脹”“廟積”等范疇，治法以清熱解毒、益氣化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)等為主[6，7]。中醫(yī)藥防治肝纖維化特色鮮明，已有多種方藥用于臨床。如有研究者采用芪葉保肝飲[8]、逍遙散[9]等復(fù)方治療肝纖維化。蘇漣等[4]研究認(rèn)為，肝纖維化是在長(zhǎng)期病理狀況下肝的氣機(jī)調(diào)節(jié)障礙、臟腑功能虛損，導(dǎo)致肝郁脾虛，瘀血阻絡(luò)，應(yīng)以健脾益氣、理氣活血、軟肝化積為治則。健脾軟肝方是蘇漣教授治療肝纖維化的有效經(jīng)驗(yàn)方[4]，該方由蘭花參、三七、莪術(shù)、白芍、香附組成，蘭花參健脾益氣、補(bǔ)虛解表，三七化瘀止血、活血止痛，白芍?jǐn)筷庰B(yǎng)血柔肝，香附疏肝理氣止痛，莪術(shù)破血行氣止痛。諸藥合用，相輔相成，行健脾益氣、理氣活血、軟肝化積之功效。前期研究已證實(shí)，健脾軟肝方能延緩肝纖維化形成。但對(duì)其可能的作用機(jī)制尚不清楚。

肝竇毛細(xì)血管化是肝纖維化過程中一個(gè)重要的病理改變，主要特征是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞失窗孔和內(nèi)皮下基底膜形成[10,11]。因此，阻止基底膜形成可延緩肝纖維化發(fā)展。研究證實(shí)，基底膜的主要成分包括ColⅣ、LN、entactin、纖維連接蛋白等[12]，其中ColⅣ、LN是肝竇基底膜形成的早期標(biāo)志物[13,14]。生理狀態(tài)下，肝竇內(nèi)皮下無基底膜。當(dāng)發(fā)生肝纖維化時(shí)，LN上的一個(gè)結(jié)構(gòu)域可與ColⅣ結(jié)合，形成十字形立體結(jié)構(gòu)異常沉積物，繼而參與基底膜形成[15]，影響肝細(xì)胞與血液間的物質(zhì)交換，使肝細(xì)胞變性、壞死和肝竇塌陷[16]，膠原纖維增生，長(zhǎng)此惡性循環(huán)即可導(dǎo)致肝纖維化形成。黃月紅等[17]研究也表明，CCl4誘導(dǎo)的早期肝纖維化大鼠基底膜是由ColⅣ與LN沉積共同構(gòu)成。

扶正化瘀膠囊是臨床常用治療肝纖維化的中成藥，其臨床療效已得到證實(shí)[18]。本研究結(jié)果顯示，扶正化瘀膠囊組與健脾軟肝方各劑量組用藥后肝組織膠原纖維沉積均減少，基底膜病變均減輕，肝組織ColⅣ、LN表達(dá)均降低，證實(shí)健脾軟肝方亦具有抗肝纖維化作用，與前期研究[19]結(jié)果一致。為進(jìn)一步探討健脾軟肝方抗肝纖維化作用與基底膜有關(guān)，我們觀察了肝竇基底膜超微結(jié)構(gòu)及肝竇基底膜形成的早期標(biāo)志物ColⅣ、LN表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組電鏡下可見連續(xù)或不完整的基底膜形成，肝組織ColⅣ、LN mRNA及LN蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯增加；與模型組比較，扶正化瘀膠囊組與健脾軟肝方各劑量組肝竇內(nèi)皮下基底膜形成延緩，Disse間隙內(nèi)膠原纖維較少，肝組織ColⅣ、LN mRNA及LN蛋白表達(dá)降低。健脾軟肝方各劑量組ColⅣ mRNA表達(dá)降低以中劑量組最為顯著，高、低劑量組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其原因可能與樣本較少有關(guān)。在下一步的工作中，我們將進(jìn)一步對(duì)健脾軟肝方抗肝纖維化是否通過作用于ColⅣ、LN起效、可能涉及哪些信號(hào)通路、如何調(diào)控進(jìn)行深入研究，以期明確其作用機(jī)制，豐富健脾軟肝方治療肝纖維化的科學(xué)內(nèi)涵。

綜上所述，健脾軟肝方能延緩CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠基底膜形成，發(fā)揮抗肝纖維化作用；其作用機(jī)制可能與降低肝組織ColⅣ、LN表達(dá)有關(guān)。

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