沉默Ephrin B2基因表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及其機(jī)制

張旭，陳旺盛，文坤明，張夢嬌，梁雪梅

(1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生的肝細(xì)胞受體(EPH)家族是受體酪氨酸激酶家族中最大的亞族，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[1]。EPH家族包括受體Eph和配體肝配蛋白(Ephrin)。肝配蛋白B2(Ephrin B2)是配體Ephrin的亞型之一，作為一種跨膜蛋白通過其胞外部分與相應(yīng)受體Eph B4結(jié)合，激活Eph B4介導(dǎo)的正向信號通路，同時受體Eph B4也會使Ephrin B2胞內(nèi)部分發(fā)生磷酸化，從而激活Ephrin B2介導(dǎo)的逆向信號通路，形成特有的雙向信號調(diào)節(jié)通路，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)作用[2,3]。目前關(guān)于Ephrin B2介導(dǎo)的逆向信號通路在腫瘤中的作用仍存在爭議，多數(shù)研究傾向于經(jīng)Ephrin B2介導(dǎo)的逆向信號通路與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[4～6]，但其作用機(jī)制尚不清楚。近年研究證實，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用[7]。而Ephrin B2是否通過調(diào)控EMT過程參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移尚不十分清楚。2016年8月～2017年7月，本研究觀察了沉默Ephrin B2基因表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞(以下稱SW480細(xì)胞)，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。Ephrin B2干擾質(zhì)粒載體(Ephrin B2-siRNA)及對照質(zhì)粒載體(NC-siRNA)，由天津賽爾生物技術(shù)有限公司構(gòu)建、篩選、包裝。所有引物序列由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司設(shè)計合成。Transwell小室，美國Millipore公司；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol、SYBR?Premix Ex TaqTM，日本TaKaRa公司。兔抗人Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗，美國Epitomics公司；兔抗人GAPDH一抗及HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Loading buffer、蛋白質(zhì)Marker、Lipofectamine2000、結(jié)晶紫染液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 沉默Ephrin B2基因表達(dá)及其效果驗證 將SW480細(xì)胞置于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。收集SW480細(xì)胞，0.25%胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，以2×105個/孔接種于6孔板(內(nèi)含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨機(jī)將細(xì)胞分為Ephrin B2組、陰性對照組、空白對照組，當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%時，更換為無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，Ephrin B2組加入Ephrin B2-siRNA 1 μg+Lipofectamine2000 3 μL，陰性對照組加入NC-siRNA 1 μg+Lipofectamine2000 3 μL，空白對照組僅加入Lipofectamine2000 3 μL。各組轉(zhuǎn)染8 h，更換新的含10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)蛋白核酸分析儀檢測，OD260/OD280為1.8～2.0。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTM說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：Ephrin B2上游引物5′-CGATTGAGCCTTACGACAC-3′，下游引物5′-TTTTAAGCGCTGAGCATTG-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。PCR反應(yīng)體系共25 μL：ddH2O 8.5 μL，5 pmol/μL Primer1 1 μL，5 pmol/μL Primer2 1 μL，cDNA 2 μL，SYBR Green Mix Taq 12.5 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s共40個循環(huán)，65 ℃ 5 s，72 ℃ 5 min。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，Ephrin B2組、陰性對照組、空白對照組Ephrin B2 mRNA相對表達(dá)量分別為0.283±0.060、0.813±0.050、1.000±0.000。Ephrin B2組Ephrin B2 mRNA相對表達(dá)量明顯低于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較P>0.05。證實Ephrin B2-siRNA能夠沉默Ephrin B2基因表達(dá)。

1.3 沉默Ephrin B2基因表達(dá)對SW480細(xì)胞侵襲能力影響的觀察 采用Transwell侵襲實驗。將Martrigel膠置于4 ℃冰箱中過夜解凍，以無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基∶Martrigel膠=1∶8比例稀釋。取100 μL稀釋后的Martrigel膠置于Transwell小室底部，將小室置于37 ℃下風(fēng)干。取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的SW480細(xì)胞，按1.2方法進(jìn)行分組、轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染8 h，更換新的含10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，0.25%胰酶消化，制成密度為6×105個/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液0.4 mL加入Transwell小室上室，下室加入含10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基0.6 mL，將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，取出小室，吸盡上室培養(yǎng)基，PBS清洗，多聚甲醛固定20 min，自然風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，用棉簽擦去上室未穿透細(xì)胞及Martrigel膠。PBS沖洗干凈，自然風(fēng)干，甘油封片，顯微鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，以此反映細(xì)胞侵襲能力。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 沉默Ephrin B2基因表達(dá)對SW480細(xì)胞遷移能力影響的觀察 采用劃痕修復(fù)實驗。選擇1.3中的細(xì)胞懸液1 mL接種于6孔板(內(nèi)含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，用10 μL槍頭劃過細(xì)胞，用PBS洗盡漂浮的細(xì)胞；加入含1.5% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下拍照觀察培養(yǎng)0、24 h細(xì)胞遷移情況，Image-Pro Plus軟件測量劃痕24 h細(xì)胞遷移距離。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 沉默Ephrin B2基因表達(dá)對SW480細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達(dá)影響的觀察 ①E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)：采用Western blotting法。按1.2中方法進(jìn)行分組、轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染8 h，更換新的含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。按全蛋白提取試劑盒說明提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量后，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白50 μg恒壓下行SDS-PAGE，按濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜。取出PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入E-cadherin(1∶2 000)、N-cadherin(1∶2 000)、Vimentin(1∶5 000)、GAPDH(1∶5 000)一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫避光孵育1 h。ECL發(fā)光顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白電泳條帶，Quantity One軟件分析各蛋白電泳條帶的灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值/內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值作為目的蛋白相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取平均值。②E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)：采用qRT-PCR法。具體步驟參照1.2。引物序列：E-cadherin上游引物5′-CTTCTCTCACGCTGTGTCATC-3′，下游引物5′-CTCCTGTGTTCCTGTTAATGGT-3′；N-cadherin上游引物5′-ACTCGGCTTAATGGTGAT-3′，下游引物5′-CACTGGCAAACCTTCACG-3′；Vimentin上游引物5′-AGGCAAAGCAGGAGTCCA-3′，下游引物5′-TATCAACCAGAGGGAGTG-3′。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 見表1。

2.2 各組N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)比較 見表2、3。

3 討論

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危及人民生命健康的惡性腫瘤，近年來雖然在全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病率及病死率有所下降，但由于我國人口基數(shù)大，每年的發(fā)病例數(shù)及死亡例數(shù)均居世界第1位，并呈年輕化趨勢[8]。雖然手術(shù)方式不斷改進(jìn)、抗腫瘤新藥不斷涌現(xiàn)，但結(jié)直腸癌患者的總生存期仍不理想，尤其是中晚期結(jié)直腸癌患者。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的最重要原因，也是治療失敗導(dǎo)致患者死亡的重要原因。因此，探索結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制具有重要意義。

表1 各組細(xì)胞侵襲和遷移能力比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

表2 各組N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白相對表達(dá)量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

表3 各組N-cadherin、Vimentin、E-cadherin mRNA相對表達(dá)量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

近年來，EPH家族在腫瘤中的作用逐漸被重視。EPH家族包括Eph受體(Eph A1～Eph A10，Eph B1～Eph B6)和配體Ephrin(Ephrin A1～Ephrin A6，Ephrin B1～Ephrin B6)兩部分，其家族成員在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[9]。Ephrin B2是一種跨膜的內(nèi)嵌蛋白，由通過GPI與受體連接的胞外區(qū)、含PDZ結(jié)構(gòu)域和酪氨酸激酶結(jié)合位點(diǎn)的胞內(nèi)區(qū)組成。Ephrin B2主要與受體Eph B4、Eph B3、Eph B2結(jié)合。但Ephrin B2與Eph B4的親和力更高，可形成特有的雙向信號傳導(dǎo)通路，即由配體Ephrin B2為媒介作用于受體Eph B4使其發(fā)生磷酸化，從而激活下游信號傳導(dǎo)分子形成正向信號傳導(dǎo)通路，同時受體Eph B4介導(dǎo)激活配體Ephrin B2胞外區(qū)，使其發(fā)生磷酸化，繼而激活其下游信號傳導(dǎo)分子所形成的反向信號傳導(dǎo)通路。Ephrin B2與Eph B4形成的雙向信號通路在血管生成、神經(jīng)發(fā)育、骨骼再生、細(xì)胞遷移等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用[10，11]。但目前關(guān)于Ephrin B2在腫瘤中的作用仍有爭議。有研究發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2在食管癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[12，13]。而Depner等[14]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Ephrin B2表達(dá)可抑制某些腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。由此可見，Ephrin B2在腫瘤中的作用即可發(fā)揮癌基因作用，又能發(fā)揮抑癌基因作用。但其在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的作用及其機(jī)制尚不十分清楚，仍需進(jìn)一步研究。

普遍認(rèn)為，EMT在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[15]。EMT可使具有極性的、相對穩(wěn)定的上皮細(xì)胞通過一系列生化過程轉(zhuǎn)變成能在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動的間質(zhì)細(xì)胞。EMT是一個非常復(fù)雜的分子過程，涉及多個信號通路，如TGF-β1通路、Hedgehog通路、Notch通路、Wnt通路等。各信號通路間彼此相互作用，激活一些轉(zhuǎn)錄因子，如鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail、堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子Twist、鋅指E盒結(jié)合蛋白ZEB，共同參與導(dǎo)致上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin下調(diào)及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-cadherin、Vimentin表達(dá)上調(diào)。EMT可使腫瘤細(xì)胞喪失細(xì)胞極性和細(xì)胞彼此間的連接，使其侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[16]。但EMT并不是一成不變的，腫瘤細(xì)胞通過EMT獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，在到達(dá)一個新的生長環(huán)境后，又可通過一些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)發(fā)生間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)，從而獲得具有上皮細(xì)胞表型和特性的細(xì)胞固定下來，繼而增殖形成新的病灶。眾多轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT和MET過程中發(fā)揮了重要作用，有可能成為預(yù)測腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物。Ephrin B2是否通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的EMT過程發(fā)揮作用尚不清楚。

本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默SW480細(xì)胞Ephrin B2基因表達(dá)，觀察沉默Ephrin B2基因表達(dá)對SW480細(xì)胞侵襲和遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2組細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力均明顯低于陰性對照組和空白對照組，而陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明沉默Ephrin B2基因表達(dá)能抑制SW480細(xì)胞侵襲和遷移。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2組E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)均明顯低于陰性對照組、空白對照組，N-cadherin、Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)均明顯高于陰性對照組、空白對照組，而陰性對照組與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。表明沉默Ephrin B2基因表達(dá)抑制SW480細(xì)胞侵襲和遷移的機(jī)制可能與調(diào)控EMT過程有關(guān)。

綜上所述，沉默Ephrin B2基因表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移，其機(jī)制可能與調(diào)控EMT過程有關(guān)。但其具體調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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