普伐他汀預(yù)處理對香煙提取物誘導(dǎo)的小鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制研究

廖思聰，祁春雷，王大新

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)，其特征性病理改變是AS斑塊形成。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）在維持血管穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。既往研究結(jié)果顯示，凋亡或壞死的VSMCs是構(gòu)成AS斑塊最重要的成分之一，但AS形成過程較為復(fù)雜，具體機(jī)制尚未完全闡明［1-4］。吸煙是心血管疾病明確的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，但其確切作用機(jī)制至今尚未完全闡明［5-6］。他汀類藥物是治療心血管疾病的常用藥物之一，具有調(diào)脂、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多重作用［7-8］，其是否對吸煙引起的血管損傷具有保護(hù)作用目前尚不清楚。本研究旨在探討普伐他汀預(yù)處理對香煙提取物（cigarette smoke extract，CSE）誘導(dǎo)的小鼠VSMCs凋亡的影響及可能機(jī)制，為臨床有效防治AS提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 Bcl-2抗體和Chop抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Bax抗體和GRP78抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin抗體、普伐他汀和4-苯基丁酸（4-PBA）購自美國Sigma Aldrich公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自美國Merck Millipore公司，ECL顯影試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，紅金龍香煙購自湖北中煙工業(yè)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物公司，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶公司，Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)公司，RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增試劑盒購自北京天根生化科技公司。

1.1.2 主要儀器 BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司；Tecan M2000多功能酶標(biāo)儀購自美國Tecan公司；ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 制備 CSE 2017年 6月—2018年 1月，參照DAMICO等［9］的實(shí)驗(yàn)方法制作負(fù)壓吸引裝置，制備本實(shí)驗(yàn)所需的CSE，具體如下：1支香煙包含焦油10.0 mg、尼古丁0.9 mg，使用50 ml針筒通過負(fù)壓吸引裝置將煙霧抽吸入盛有20 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）的密閉燒瓶內(nèi)，持續(xù)抽吸3～5 min直至香煙燃盡。抽吸完畢后將溶液經(jīng)0.22 μm孔徑濾器過濾除菌，即得到濃度為100%的CSE原液，在CSE原液中加入DMEM培養(yǎng)基分別配制含1%、5%、10% CSE的DMEM培養(yǎng)基，配制好的培養(yǎng)基須在30 min內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠VSMCs由南京醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)系惠贈(zèng)，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、含5%二氧化碳（CO2）的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。采用0.25%胰酶消化傳代，取10代以內(nèi)生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 （1）將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為不同濃度CSE誘導(dǎo)組，其中空白組使用不含CSE的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，低濃度組、中濃度組、高濃度組分別于含1%、5%、10% CSE的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。（2）將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為不同劑量普伐他汀預(yù)處理組，其中對照組使用不含普伐他汀的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予1 μM、10 μM、100 μM普伐他汀預(yù)處理2 h，然后使用含5% CSE的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；部分實(shí)驗(yàn)設(shè)置陽性對照組，陽性對照組細(xì)胞給予4-PBA 2 mM預(yù)處理2 h，然后使用含5% CSE的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。

1.3 流式細(xì)胞術(shù) 嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，根據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻于細(xì)胞膜外側(cè)的原理分析細(xì)胞凋亡情況，具體如下：消化收集細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞密度約為5×105個(gè)/ml，4℃、1 000 r/min離心5 min，預(yù)冷PBS漂洗細(xì)胞2次；棄上清，將細(xì)胞重懸于100 μl Binding Buffer，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI充分混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，隨后加入400 μl PBS，30 min內(nèi)采用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 采用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)各目的基因及內(nèi)參基因GAPDH的引物序列，由生工生物工程（上海）有限公司合成引物。各引物序列如下：Bcl-2正向引物：5'-CCAGGACGTCTCCTCTCAGG-3'，反向引物：5'-AAGATGGTGATGGGCTTCCCG-3'；Bax正向引物：5'-CGTGAGCG GCTGCTTGTCTG-3'，反向引 物：5'-TGGTGAGCGAGGCGGTGAG-3'；GRP78正向引物：5'-GCGTCGGTGTGTTCAAGAAC-3'，反向引物：5'-AAGGGTCATTCCAAGTGCGT-3'；Chop正向引物：5'-CCAACAGAGGTCACACGCACATC-3'，反向引物：5'-TCGTTCTCCTGCTCCTTCTCCTTC-3'；GAPDH正 向 引 物：5'-TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC-3'，反向引物：5'-AAGATGGTGATGGGCTTCCCG-3'。參照總RNA提取試劑盒操作說明提取細(xì)胞總RNA，采用cDNA合成試劑盒合成cDNA，隨后加入SYBR Green試劑并經(jīng)Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測分析，最后通過擴(kuò)增曲線、溶解曲線及各目的基因CT值確認(rèn)擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-??CT法計(jì)算各目的基因mRNA相對表達(dá)量。

1.5 Western Blot 嚴(yán)格按照RIPA蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，每孔加入200 μl含1%蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，冰上充分裂解10 min后，4 ℃、12 000×g離心10 min，吸取上清。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測各目的蛋白濃度。將蛋白樣本與5 X蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸10 min使蛋白充分變性，置于-20 ℃冰箱中保存。每孔總蛋白上樣量為30 μg，使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜后5%脫脂奶粉封閉2 h。分別采用Bcl-2抗體（1:1 000）、Bax抗體（1:1 000）、GRP78抗體（1:1 000）、Chop抗體（1:1 000）和β-actin抗體（1:3 000）于4 ℃孵育過夜，次日用含0.1%吐溫-20的PBS（簡稱PBST）溶液洗膜3次，對應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，PBST溶液洗膜3次后經(jīng)ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)檢測各條帶灰度值。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，各目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值即為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CSE誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，空白組細(xì)胞凋亡率為（6.13±1.71）%，低 濃 度 組 為（14.20±1.53）%， 中 濃 度 組 為（24.18±2.44）%，高濃度組為（30.64±2.52）%。不同濃度CSE誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=80.11，P＜0.05）；低濃度組、中濃度組和高濃度組細(xì)胞凋亡率高于空白組，中濃度組和高濃度組細(xì)胞凋亡率高于低濃度組，高濃度組細(xì)胞凋亡率高于中濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖1）。

礦粒在螺旋槽內(nèi)分選主要受水流運(yùn)動(dòng)特性影響。在弱紊流作用下礦粒在螺旋溜槽內(nèi)松散和分層。重顆粒集中在下層，并與槽體接觸，在上部物料的壓力下，其運(yùn)動(dòng)阻力大；而處在上部流動(dòng)層的輕顆粒所受阻力較小，因此增大了上下層之間流動(dòng)速度差。輕礦物顆粒位于縱向流速高的上層流中，所受離心力較大，同時(shí)受到橫向環(huán)流給予的向外的流體動(dòng)壓力，這兩種力的合力大于顆粒的重力分力和摩擦力，所以輕礦物顆粒向槽的外緣移動(dòng)；與之相反重礦物顆粒富集于內(nèi)緣。礦粒在螺旋面上的分帶如圖4所示[9]。

圖1 不同濃度CSE誘導(dǎo)組流式細(xì)胞圖Figure 1 Flow cytometry results of VSMCs with different induction concentrations of CSE

2.2 不同濃度CSE誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 不同濃度CSE誘導(dǎo)組Bcl-2、Bax mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。低濃度組、中濃度組和高濃度組Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量低于空白組，中濃度組和高濃度組Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量低于低濃度組，高濃度組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量低于中濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低濃度組、中濃度組和高濃度組Bax mRNA和蛋白相對表達(dá)量高于空白組，中濃度組和高濃度組Bax mRNA和蛋白相對表達(dá)量高于低濃度組，高濃度組Bax mRNA相對表達(dá)量高于中濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 不同濃度CSE誘導(dǎo)組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）途徑相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 不同濃度CSE誘導(dǎo)組GRP78、Chop mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低濃度組、中濃度組、高濃度組GRP78、Chop mRNA和蛋白相對表達(dá)量高于空白組，中濃度組、高濃度組GRP78、Chop mRNA和蛋白相對表達(dá)量高于低濃度組，高濃度組GRP78 mRNA、Chop蛋白相對表達(dá)量高于中濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表 2）。

表1 不同濃度CSE誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較（）Table 1 Comparisons of relative quantity expression of apoptosis-related protein of VSMCs with different induction concentration of CSE

表1 不同濃度CSE誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較（）Table 1 Comparisons of relative quantity expression of apoptosis-related protein of VSMCs with different induction concentration of CSE

注：與空白組比較，aP＜0.05；與低濃度組比較，bP＜0.05；與中濃度組比較，cP＜0.05

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表2 不同濃度CSE誘導(dǎo)組ERS途徑相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較（）Table 2 Comparisons of relative quantity expression ERS pathway related proteins of VSMCs with different induction concentration of CSE

表2 不同濃度CSE誘導(dǎo)組ERS途徑相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較（）Table 2 Comparisons of relative quantity expression ERS pathway related proteins of VSMCs with different induction concentration of CSE

注：與空白組比較，aP＜0.05；與低濃度組比較，bP＜0.05；與中濃度組比較，cP＜0.05

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2.4 不同劑量普伐他汀預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率比較流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為（26.63±1.92）%，低劑量組為（21.31±2.25）%，中劑量組為（16.51±2.43）%，高劑量組為（22.67±1.37）%。不同濃度CSE誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=80.11，P＜0.05）；低劑量組、中劑量組、高劑量組細(xì)胞凋亡率低于對照組，中劑量組細(xì)胞凋亡率低于低劑量組和高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖2）。

圖2 不同劑量普伐他汀預(yù)處理組流式細(xì)胞圖Figure 2 Flow cytometry results of VSMCs with different doses of prevastatin pretreatment

2.5 不同劑量普伐他汀預(yù)處理組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 不同劑量普伐他汀預(yù)處理組Bcl-2和Bax蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量組、中劑量組、高劑量組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量高于對照組，Bax蛋白相對表達(dá)量低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量組Bax蛋白相對表達(dá)量低于低劑量組和高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

表3 不同劑量普伐他汀預(yù)處理組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較（）Table 3 Comparisons of relative quantity expression of apoptosis-related protein of VSMCs with different doses of prevastatin pretreatment

表3 不同劑量普伐他汀預(yù)處理組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較（）Table 3 Comparisons of relative quantity expression of apoptosis-related protein of VSMCs with different doses of prevastatin pretreatment

注：與對照組比較，aP＜0.05；與中劑量組比較，bP＜0.05

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2.6 不同劑量普伐他汀預(yù)處理組ERS途徑相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 不同劑量普伐他汀預(yù)處理組GRP78、Chop蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組GRP78和Chop蛋白相對表達(dá)量低于對照組，低劑量組、中劑量組、高劑量組GRP78蛋白相對表達(dá)量低于陽性對照組，中劑量組GRP78蛋白相對表達(dá)量低于低劑量組、Chop蛋白相對表達(dá)量低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表 4）。

表4 不同劑量普伐他汀預(yù)處理組ERS途徑相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較（）Table 4 Comparisons of relative quantity expression of ERS pathway related proteins of VSMCs with different doses of prevastatin pretreatment

表4 不同劑量普伐他汀預(yù)處理組ERS途徑相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較（）Table 4 Comparisons of relative quantity expression of ERS pathway related proteins of VSMCs with different doses of prevastatin pretreatment

注：與對照組比較，aP＜0.05；與陽性對照組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05

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3 討論

VSMCs是維持血管穩(wěn)態(tài)最主要的細(xì)胞，其功能異?？纱龠M(jìn)AS等慢性炎性疾病發(fā)生發(fā)展，但既往研究主要集中在VSMCs增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化等病理生理機(jī)制。近年研究表明，VSMCs凋亡在心肌梗死、腦卒中、肺動(dòng)脈高壓等發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用［10-12］。凋亡的VSMCs可在局部組織釋放白介素1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）等細(xì)胞因子，引發(fā)炎性反應(yīng)，促進(jìn)易損斑塊和壞死核心形成，加速血管衰老及鈣化形成［13-14］，直接或間接導(dǎo)致血管穩(wěn)態(tài)失衡，可能參與AS的發(fā)生發(fā)展［15-16］。

吸煙是公認(rèn)的心血管疾病獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也是肺部疾病的重要致病因素。香煙暴露能引起炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和補(bǔ)體激活等病理生理改變，還可直接導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞凋亡［9，17］。YANG等［18］研究發(fā)現(xiàn)，CSE可通過多種細(xì)胞機(jī)制促進(jìn)AS形成、發(fā)展，包括氧化應(yīng)激、脂質(zhì)紊亂及血管炎癥等。本研究通過CSE模擬香煙暴露對VSMCs凋亡的影響，結(jié)果顯示，低濃度組、中濃度組和高濃度組細(xì)胞凋亡率及Bax mRNA、蛋白相對表達(dá)量高于空白組，Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量低于空白組；中濃度組和高濃度組細(xì)胞凋亡率及Bax mRNA、蛋白相對表達(dá)量高于低濃度組，Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量低于低濃度組；高濃度組細(xì)胞凋亡率和Bax mRNA相對表達(dá)量高于中濃度組，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量低于中濃度組；提示CSE可誘導(dǎo)小鼠VSMCs凋亡，下調(diào)具有抗凋亡作用的Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)，上調(diào)具有促凋亡作用的Bax mRNA和蛋白表達(dá)，且呈濃度依賴性。既往研究表明，各種原因所致細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境紊亂均可引發(fā)ERS，其中GRP78和Chop是ERS標(biāo)志信號分子，Chop表達(dá)上調(diào)可激活Bcl-2蛋白家族，而后者能促進(jìn)線粒體依賴細(xì)胞凋亡，進(jìn)而參與AS形成［19］。本研究結(jié)果顯示，低濃度組、中濃度組、高濃度組GRP78、Chop mRNA和蛋白相對表達(dá)量高于空白組，中濃度組、高濃度組GRP78、Chop mRNA和蛋白相對表達(dá)量高于低濃度組，高濃度組GRP78 mRNA、Chop蛋白相對表達(dá)量高于中濃度組，提示CSE作用于VSMCs后可上調(diào)ERS標(biāo)志信號分子GRP78和Chop表達(dá)，且呈濃度依賴性，故筆者推測香煙暴露可能通過ERS途徑誘導(dǎo)VSMCs凋亡。

他汀類藥物除具有較強(qiáng)的調(diào)脂作用外，還具有抗炎、抗血栓、抗氧化應(yīng)激等多重作用。LI等［20］研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可降低小鼠血管組織中血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的GRP78、Chop表達(dá)及TUNEL染色陽性凋亡細(xì)胞數(shù)量。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血管緊張素Ⅱ可介導(dǎo)ERS途徑的VSMCs和巨噬細(xì)胞凋亡，而辛伐他汀可部分抑制上述過程，表現(xiàn)為Chop、Caspase 12、GRP78等蛋白表達(dá)降低。ZHANG等［21］研究結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀可有效降低移植到小鼠心臟的脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡率，上調(diào)Bcl-xL和Bcl-2等抗凋亡蛋白表達(dá)，并下調(diào)Bim和Bax等促凋亡蛋白表達(dá)，提示他汀類藥物可能在多種組織細(xì)胞中具有抗凋亡作用。但也有研究顯示，他汀類藥物在腫瘤細(xì)胞中具有促凋亡作用［22-23］，提示他汀類藥物對細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用可能與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因素、他汀類藥物種類及細(xì)胞類型等有關(guān)［24］。本研究結(jié)果顯示，低劑量組、中劑量組、高劑量組細(xì)胞凋亡率低于對照組，中劑量組細(xì)胞凋亡率低于低劑量組和高劑量組；低劑量組、中劑量組、高劑量組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量高于對照組，Bax蛋白相對表達(dá)量低于對照組；中劑量組Bax蛋白相對表達(dá)量低于低劑量組和高劑量組；提示普伐他汀預(yù)處理可有效降低CSE誘導(dǎo)的小鼠VSMCs凋亡率、上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)及下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，且采用10 μM普伐他汀預(yù)處理的抗凋亡作用最佳。本研究結(jié)果還顯示，陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組GRP78和Chop蛋白相對表達(dá)量低于對照組，低劑量組、中劑量組、高劑量組GRP78蛋白相對表達(dá)量低于陽性對照組，中劑量組GRP78蛋白相對表達(dá)量低于低劑量組、Chop蛋白相對表達(dá)量低于陽性對照組；提示普伐他汀預(yù)處理可下調(diào)ERS標(biāo)志信號分子GRP78和Chop蛋白的表達(dá)，推測他汀類藥物抗細(xì)胞凋亡作用可能與調(diào)控ERS信號途徑有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)：王大新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，論文審校并對文章負(fù)責(zé)；廖思聰進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施，資料收集整理，負(fù)責(zé)撰寫論文；祁春雷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評估，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

本文無利益沖突。

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