甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型板藍根對小鼠抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用的比較*

趙澤軍，王志旺，郭 玫，杜，師 霞，邵 晶，文喜艷

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州730000）

板藍根為菘藍（Isatis tinctorria L.）或馬藍（Baphicacanthus cusia）的干燥根，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載并使用超過2千年，是傳統(tǒng)的清熱解毒中藥之一，其性寒、氣微、味微甜后苦澀，歸心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、消腫利咽之功效，主要產(chǎn)于黃河流域。由于我國地域遼闊，不同生態(tài)型的板藍根其品質(zhì)有一定的差異并可能影響其藥效；另一方面，隨著四倍體板藍根（染色體數(shù)目加倍）的栽培，四倍體板藍根的功效有待于進一步考察。鑒于此，將采自不同產(chǎn)地板藍根和四倍體板藍根的種子栽培于甘肅省和政縣，從抗炎、免疫調(diào)節(jié)等方面來探討生態(tài)型與四倍染色體對板藍根藥理作用的影響，為我省板藍根優(yōu)良品種的選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

板藍根，將河北石家莊市、甘肅隴西縣、山西左權(quán)縣等地購買的板藍根種子（包括河北石家莊市四倍體板藍根種子）種植于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)和政藥用植物園，經(jīng)杜教授鑒定為十字花科植物菘藍lsatis indigotica Fort的干燥根。吲哚美辛片，廣東華南藥業(yè)集團有限公司產(chǎn)品，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H44020701，產(chǎn)品批號：20150912。注射用環(huán)磷酰胺，Baxter Oncology GmbH（德國），批準(zhǔn)文號：H20110407，產(chǎn)品批號：5H072A。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，生產(chǎn)批號：20160502、20160504；白 三 烯 B4（leukotriene B4，LTB4）、考馬斯亮藍蛋白試劑盒，上海瑞齊生物科技有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號：20160602、201600601；白介素-4（interleukin-4，IL-4）、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、α-腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）測試盒，深圳達科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號 E6050-1202-3、E6040-1206-1、E6060-1209-1。其余試劑為分析純。

1.2 儀器

電子天平（BS1103 sartorius），北京賽多里斯有限公司；恒溫水浴鍋（HH-S），金壇市正基儀器有限公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機（TGL-16G），上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.3 動物

SPF級KM小鼠209只，雌雄兼用，體重（20±2）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗動物中心提供，動物許可證：SCXK（甘）2015-0002；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗動物中心飼養(yǎng)，實施許可證：SYXK（甘）2015-0005。

1.4 甘肅產(chǎn)不同品系板藍根對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響［1］

將小鼠隨機分成6組，即空白對照組、吲哚美辛組（8 mg／kg）、石家莊二倍體板藍根組（Shijiazhuang diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu，SJZ-2）（5 g／kg）、石家莊四倍體板藍根組（Shijiazhuang tetraploid Isatidis Radixcultivated in Gansu，SJZ-4）（5 g／kg）、隴西二倍體板藍根組（Longxi diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu，LX-2）（5 g／kg）、左權(quán)二倍體板藍根組（Zuoquan diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu，ZQ-2）（5 g／kg）。按上述劑量灌胃給藥20 ml／kg，每日 1次，連續(xù)4 d。最后一次給藥1 h后，各小鼠右耳兩側(cè)涂抹50μl二甲苯，致炎30 min后處死動物，剪下雙耳，用內(nèi)徑9 mm打孔器在雙耳相同部位取耳片，精密稱重，以左右耳片重量差值表示腫脹度，并以下式計算腫脹抑制率：腫脹抑制率（%）＝

1.5 甘肅產(chǎn)不同品系板藍根對甲醛所致小鼠足腫脹的影響［2］

小鼠分組、給藥同1.4。末次給藥后，于各小鼠右后足足墊皮下注射5%甲醛50μl，致炎4 h后處死動物，在小鼠后足同一部位處剪下左右后足，精密稱重，以左右后足重量差值表示腫脹度，并計算腫脹抑制率。

1.6 甘肅產(chǎn)不同品系板藍根對甲醛致小鼠氣囊滑膜炎的影響［3-5］

將小鼠隨機分成7組：即空白對照組、模型對照組、吲哚美辛組（8 mg／kg）、石家莊二倍體板藍根組（SJZ-2）（5 g／kg）、石家莊四倍體板藍根組（SJZ-4）（5 g／kg）、隴西二倍體板藍根組（LX-2）（5 g／kg）、左權(quán)二倍體板藍根組（ZQ-2）（5 g／kg）。按上述劑量灌胃給藥20 ml／kg，每日1次，連續(xù)7 d。在第1次給藥后于小鼠背部皮下注入空氣5 ml，第3天及第5天再次注入空氣以維持氣囊的大小，第6天向小鼠背部氣囊內(nèi)注入1%甲醛0.2 ml，致炎8 h后麻醉、取血，分取血清測定SOD與MDA的含量；處死動物，向氣囊內(nèi)注入生理鹽水進行灌洗、測定灌洗液中總蛋白及LTB4的含量。

1.7 甘肅產(chǎn)不同品系板藍根對環(huán)磷酰胺模型小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用［6，7］

將小鼠隨機分成6組：即空白對照組、模型對照組、石家莊二倍體板藍根組（SJZ-2）（5 g／kg）、石家莊四倍體板藍根組（SJZ-4）（5 g／kg）、隴西二倍體板藍根組（LX-2）（5 g／kg）、左權(quán)二倍體板藍根組（ZQ-2）（5 g／kg）。按上述劑量灌胃給藥20 ml／kg，每日1次，連續(xù)7 d。從第4天開始，給藥1 h后，小鼠皮下注射環(huán)磷酰胺20 mg／kg，連續(xù)注射4 d；空白對照組皮下注射生理鹽水。末次給藥1 h后麻醉動物，取血經(jīng)抗凝后用血細胞分析儀作血常規(guī)檢測，其余血液分取血清，測定其中 IFN-γ、IL-4與 TNF-α的水平。小鼠頸椎脫臼處死，摘取胸腺、脾臟，稱量，計算臟器指數(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析和描述。

2 結(jié)果

2.1 甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型板藍根對小鼠耳、足腫脹的影響

小鼠耳廓涂抹二甲苯后腫脹明顯，經(jīng)板藍根干預(yù)后，耳廓腫脹度明顯下降，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型板藍根及四倍體板藍根對耳廓腫脹度的影響未出現(xiàn)明顯差異；小鼠足趾部注射甲醛后腫脹明顯，經(jīng)板藍根干預(yù)后足廓腫脹度明顯緩解，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型板藍根及四倍體板藍根對耳廓腫脹度的影響沒有明顯差異（表1）。

Tab.1 Effects of Isatidis Radixfrom different ecotype on auricle swelling test and foot swelling test（±s，n＝11）

Tab.1 Effects of Isatidis Radixfrom different ecotype on auricle swelling test and foot swelling test（±s，n＝11）

SJZ-2：Shijiazhuang diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；SJZ-4：Shijiazhuang tetraploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；LX-2：Longxidiploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；ZQ-2：Zuoquan diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

?

2.2 甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型板藍根對小鼠氣囊滑膜炎滲出物中總蛋白、LTB4及小鼠血清SOD、MDA的影響

小鼠氣囊滑膜炎滲出物中總蛋白與LTB4明顯升高，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)板藍根干預(yù)后總蛋白與LTB4明顯下降，與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型板藍根及四倍體板藍根對小鼠氣囊滑膜炎滲出物中總蛋白及LTB4的影響沒有明顯差異；氣囊滑膜炎小鼠血清SOD明顯下降，MDA顯著上升，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)板藍根干預(yù)后上述變化得到明顯改善，與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型板藍根及四倍體板藍根對氣囊滑膜炎小鼠血清SOD、MDA的影響沒有明顯差異（表2）。

2.3 甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型板藍根對環(huán)磷酰胺模型小鼠臟器指數(shù)的影響

給小鼠注射環(huán)磷酰胺后胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)明顯下降，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在板藍根的干預(yù)下，上述變化得到了不同程度的緩解，其中胸腺指數(shù)與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型板藍根及四倍體板藍根對環(huán)磷酰胺模型小鼠臟器指數(shù)的影響未出現(xiàn)明顯差異（表3）。

Tab.2 Effects of Isatidis Radix from different ecotype on total protein and LTB4 in inflammatory exudates and SOD and MDA in serum（±s，n＝11）

Tab.2 Effects of Isatidis Radix from different ecotype on total protein and LTB4 in inflammatory exudates and SOD and MDA in serum（±s，n＝11）

SJZ-2：Shijiazhuang diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；SJZ-4：Shijiazhuang tetraploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；LX-2：Longxi diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；ZQ-2：Zuoquan diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；LTB4：Leukotriene B4；SOD：Superoxide dismutase；MDA：Malonaldehyde*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Group Total protein（mg／ml）LTB4（ng／ml）SOD（U／ml）MDA（nmol／ml ）Control 3.54±0.84** 21.33±3.71** 11.19±1.87** 6.16±1.57*Model 8.19±2.01 39.24±7.51 8.59±1.17 12.39±2.35 Indometacin 4.41±1.24** 29.25±6.22** 10.12±1.43* 9.22±2.22**SJZ-2 5.81±1.91** 27.32±5.82** 10.46±1.40** 9.08±2.15**SJZ-4 5.30±1.87** 26.50±5.56** 10.68±1.64** 8.39±2.07**LX-2 5.95±1.94* 29.20±6.53** 11.12±1.68** 7.31±1.90**ZQ-2 6.09±1.98* 31.07±6.70* 10.53±1.46** 8.92±2.15**

2.4 甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型板藍根對環(huán)磷酰胺模型小鼠紅細胞、白細胞計數(shù)的影響

給小鼠注射環(huán)磷酰胺后血液紅細胞與白細胞計數(shù)顯著下降，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在板藍根的干預(yù)下，上述血象異常變化得到明顯的緩解，紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型板藍根及四倍體板藍根對環(huán)磷酰胺模型小鼠血象的影響沒有明顯差異（表4）。

2.5 甘肅產(chǎn)不同品生態(tài)型藍根對環(huán)磷酰胺模型小鼠細胞因子的影響

環(huán)磷酰胺模型小鼠血清IFN-γ、IL-4明顯下降，而TNF-α明顯升高，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)板藍根干預(yù)后，上述異常變化得到明顯的改善，與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型板藍根及四倍體板藍根對環(huán)磷酰胺模型小鼠血清IFN-γ、IL-4、TNF-α的影響沒有明顯差異（表5）。

Tab.3 Effects of Isatidis Radixfrom different ecotype on thymus and spleen index in mice（mg／g，±s，n＝11）

Tab.3 Effects of Isatidis Radixfrom different ecotype on thymus and spleen index in mice（mg／g，±s，n＝11）

SJZ-2：Shijiazhuang diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；SJZ-4：Shijiazhuang tetraploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；LX-2：Longxi diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；ZQ-2：Zuoquan diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu**P＜0.01 vs control group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group

3.16±0.57 Group Thymus index Spleen index Control 2.42±0.38 4.04±0.71 Model 1.70±0.19** 2.99±0.48**SJZ-2 2.11±0.39## 3.10±0.65 SJZ-4 2.17±0.43## 3.34±0.74 LX-2 2.24±0.50## 3.38±0.56 ZQ-2 2.06±0.41#

Tab.4 Effects of Isatidis Radix from different ecotype on red and white cells count in mice（±s，n＝11）

Tab.4 Effects of Isatidis Radix from different ecotype on red and white cells count in mice（±s，n＝11）

SJZ-2：Shijiazhuang diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；SJZ-4：Shijiazhuang tetraploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；LX-2：Longxi diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；ZQ-2：Zuoquan diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu**P＜0.05 vs control group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group

Group Red cells count（1012／L）White cells count（109／L）Control 8.38±0.79 5.15±0.58 Model 5.64±0.63** 3.26±0.38**SJZ-2 6.43±0.70# 3.86±0.43##SJZ-4 6.50±0.69## 3.94±0.42##LX-2 6.63±0.71## 4.04±0.49##ZQ-2 6.38±0.68# 3.74±0.41##

Tab.5 Effects of Isatidis Radixfrom different ecotype on cytokines in mice（±s，n＝11）

Tab.5 Effects of Isatidis Radixfrom different ecotype on cytokines in mice（±s，n＝11）

SJZ-2：Shijiazhuang diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；SJZ-4：Shijiazhuang tetraploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；LX-2：Longxi diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；ZQ-2：Zuoquan diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；IFN-γ：Interferon-γ；IL-4：Interleukm-4；TNF-α：Tumor necrosis factor-α**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group

Group IFN-γ（pg／ml）IL-4（pg／ml）TNF-α（pg／ml ）Control 96.67±20.47 121.89±24.15 277.06±29.10 Model 44.62±8.44**76.16±16.16**466.16±42.97**SJZ-2 73.88±16.13##92.89±14.95#372.94±31.14##SJZ-4 79.18±17.98##99.12±19.52##360.62±33.46##LX-2 82.09±18.58##104.30±20.14##357.28±33.81##ZQ-2 71.72±14.98##94.78±18.03#380.66±34.53##

3 討論

生態(tài)型（ecotype）是指同一物種因生長環(huán)境不同而導(dǎo)致在結(jié)構(gòu)或功能等方面出現(xiàn)差異的不同類群，是遺傳變異與自然選擇的結(jié)果，代表了不同的基因型。一般來說，將不同生態(tài)型的物種移植于同一生境，仍保持其穩(wěn)定的差異［8］。我國地域遼闊，不同產(chǎn)地間中藥材的人工引種越來越普遍；甘肅地處西北，適宜中藥材人工種植，特別是板藍根的種植使民樂縣被譽為“中國板藍根之鄉(xiāng)”［9］。另一方面，四倍體板藍根適應(yīng)性較強，對環(huán)境要求不高，而且產(chǎn)量高。隨著喬傳卓等［10］對板藍根四倍體育種成功并推廣種植，四倍體板藍根與二倍體板藍根之間的差異、特別是藥理作用等方面的差異亦受到人們的關(guān)注，再者板藍根藥材目前品種退化問題較為嚴(yán)重?；谝陨显?，本研究組從甘肅隴西縣、山西左權(quán)縣、河北石家莊市等地采購板藍根種子（包括河北石家莊市四倍體板藍根）并種植于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)和政藥用植物園（甘肅省和政縣境內(nèi)），在考察不同生態(tài)型板藍根及四倍體板藍根的生物學(xué)特性、有效組分含量等方面差異的基礎(chǔ)上，基于清熱解毒的中藥功效對其抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用進行實驗研究，為我省板藍根優(yōu)良品種選育提供依據(jù)。

耳腫脹法與足腫脹法是抗炎實驗的經(jīng)典方法，甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型的板藍根及四倍體板藍根對小鼠耳腫脹度、足腫脹度有明顯的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型的板藍根及四倍體板藍根能明顯緩解胸腺與脾臟指數(shù)的下降趨勢、提高紅細胞計數(shù)和白細胞計數(shù)、抑制血清IFN-γ、IL-4的下降。臨床與實驗證實，機體在貧血狀態(tài)時免疫功能也會下降，而紊亂的免疫系統(tǒng)會引起造血負(fù)向調(diào)控因子如TNF-α的異常升高；不同生態(tài)型的板藍根及四倍體板藍根能明顯降低TNF-α的水平，這與之前的研究相一致［11］。在上述研究過程中，甘肅產(chǎn)不同生態(tài)型的板藍根及四倍體板藍根之間的抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用均未出現(xiàn)明顯差異，提示不同生態(tài)型的板藍根及四倍體板藍根在抗炎與免疫調(diào)節(jié)等藥理作用方面可以替代使用，為四倍體板藍根的應(yīng)用提供依據(jù)。

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