黃芪總黃酮對(duì)病毒性心肌炎小鼠心律失常與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子的影響*

劉 灝，呼日樂(lè)巴特+，熊 英，魏成喜，宣麗穎，王 羽△，趙 明△

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，通遼028000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，呼和浩特100059；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，通遼028000）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由病毒感染心肌所致的疾病，其中以柯薩奇B3病毒（coxsackievirus B3，CVB3）最為常見(jiàn)。心律失常是VMC常見(jiàn)臨床表現(xiàn)之一，嚴(yán)重者出現(xiàn)暈厥甚至阿-斯綜合征，是造成 VMC病人猝死的主要原因［1］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是一種亞細(xì)胞器，主要功能是合成蛋白質(zhì)并使合成的蛋白質(zhì)由一級(jí)結(jié)構(gòu)變成具有生理功能的空間結(jié)構(gòu)。當(dāng)各種原因?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，出現(xiàn)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常聚集并引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性蛋白分泌增加，識(shí)別錯(cuò)誤折疊蛋白，通過(guò)蛋白酶體將其降解，上述一系列反應(yīng)過(guò)程即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（endoplasmic reticulum stress，ERS）［2］。黃芪總黃酮（total flavonoids of Astragalus，TFA）是從蒙古黃芪中分離的主要活性成分，本團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)TFA可顯著降低VMC小鼠心律失常發(fā)生率［3］，并能增加 CVB3病毒感染心肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流 （IK1）的幅值［4］，抑制 CVB3病毒感染心肌細(xì)胞葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）、GRP94表達(dá)，提高 Calumenin及縫隙連接蛋白 43（connexin 43，Cx43）表達(dá)［5］，提高 VMC小鼠急性期心肌組織Cx43 mRNA表達(dá)［6］，TFA通過(guò)抑制VMC小鼠心室肌細(xì)胞LCCsα1亞單位的mRNA表達(dá)，降低心室肌細(xì)胞鈣通道開(kāi)放時(shí)間、增加關(guān)閉時(shí)間、降低開(kāi)放概率抑制心室肌細(xì)胞鈣電流，緩解心肌細(xì)胞鈣超載［7］。本研究通過(guò)觀察TFA對(duì)病毒性心肌炎小鼠心律失常及心肌細(xì)胞GRP78，激活轉(zhuǎn)錄因子 4（activating transcription factor 4，ATF4）及 Cx43表達(dá)作用，部分揭示TFA抗病毒性心肌炎并發(fā)心律失常機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物藥品與儀器

GRP78抗體，Cx43抗體和ATF4抗體購(gòu)自Boster公司，內(nèi)參β-actin購(gòu)自 wanleibio公司；BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟軟件有限公司。黃芪總黃酮系內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙藥心腦血管藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從內(nèi)蒙通遼科爾沁區(qū)兆瑞種植社出產(chǎn)蒙古黃芪中提取，對(duì)提取的黃芪總黃酮采用高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行含量測(cè)定，其6種成分的加樣回收率均＞94%。TFA干粉制備成濃度為20 mg／L水溶液。36只雄性 Balb／c小鼠，4周齡，體質(zhì)量13～15 g；CVB3（Nancy株）購(gòu)自吉林大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心病毒室，病毒原液效價(jià)為10-3 TCID 50／L。

1.2 病毒性心肌炎BALB／c小鼠模型的制備

選清潔級(jí)雄性小鼠36只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、病毒性心肌炎組和TFA組（n＝12）。病毒感染組與TFA組腹腔內(nèi)無(wú)菌注射含0.1 ml 10-950TCID CVB3，正常對(duì)照小鼠組不注射CVB3病毒，注射0.1 ml生理鹽水，每日注射1次，共3 d。TFA組小鼠每日尾靜脈注射 0.1 ml TFA 20 mg／L，共 7 d。從注射病毒起每日觀察小鼠的一般狀態(tài)，主要觀察小鼠的反應(yīng)，詳細(xì)記錄小鼠飲食，毛色，活動(dòng)和排泄情況。

1.3 心電圖檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠腹腔注射2%戊巴比妥進(jìn)行麻醉，BL420生理儀下行標(biāo)II導(dǎo)聯(lián)心電圖檢查。

1.4 病理取材及切片制作

心電圖檢查后，立即處死小鼠，在無(wú)菌狀態(tài)下剪開(kāi)小鼠左肋，去除心包后暴露心臟，取出心臟，將左心室肌組織放入4%多聚甲醛溶液固定、經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋、將心肌切片脫蠟、二甲苯透明，行HE染色，于光鏡下觀察病理變化。

1.5 Western blot檢測(cè)各組小鼠心肌細(xì)胞GRP78、ATF4及Cx43表達(dá)

各組小鼠心肌細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，采用SDS-PAGE分離后，5%BSA封閉，加入一抗 GRP78（1∶1 000），ATF4（1∶1 000），Cx43（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜后，二抗孵育1 h。ECL顯影檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞GRP78與ATF4和Cx43表達(dá)。。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SSPS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間均數(shù)比較采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠精神、飲食、活動(dòng)、毛色及死亡數(shù)量的變化

對(duì)照組小鼠毛發(fā)光亮，體質(zhì)量隨時(shí)間增加，病毒性心肌炎組小鼠毛發(fā)灰暗，躁動(dòng)不安，體質(zhì)量明顯減輕，不喜飲食，黃芪總黃酮組小鼠體重有所減輕，飲食略差，3組小鼠飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均未出現(xiàn)死亡。

2.2 各組小鼠心電圖的變化

對(duì)照組小鼠心電圖未見(jiàn)明顯異常；病毒性心肌炎組小鼠極易出現(xiàn)心率失常，以室性早搏、短陣室速為主，黃芪總黃酮小鼠出現(xiàn)心律失常較模型組減少，并以室早為主（圖1）。

Fig.1 Changes of electrocardiogramwere analyzed in three groups

2.3 光鏡下心肌組織的變化

HE染色顯示：病毒性心肌炎組小鼠出現(xiàn)心肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)明顯水腫，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，黃芪總黃酮組小鼠心肌纖維排列尚可，無(wú)間質(zhì)水腫，有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）。

Fig.2 Pathological changes of cardiac tissues derived from different treatment group（HE×40）

2.4 Western blot檢測(cè)各組小鼠心肌細(xì)胞GRP78、ATF4及Cx43表達(dá)的變化

與正常對(duì)照組比較，病毒性心肌炎組小鼠，GRP78、ATF4表達(dá)明顯增高，Cx43表達(dá)明顯減少（P＜0.01），黃芪總黃酮組小鼠心肌細(xì)胞 GRP78、ATF4表達(dá)明顯減少（P＜0.01），Cx43表達(dá)明顯增加（P＜0.01，圖 3，表 1）。

Tab.1 Expression changes of GRP78，ATF4 and Cx43 in cardiac tissues of each group（±s，n＝12）

Tab.1 Expression changes of GRP78，ATF4 and Cx43 in cardiac tissues of each group（±s，n＝12）

GRP78：Glucose-regulated protein 78；ATF4：Activating transcription factor 4；Cx43：Connexin 43**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs viral myocarditis group

Group GRP78 ATF4 Cx43 Control 467±41 1011±93 1402±128 Viral myocarditis 1593±148**2248±189**300±37**Total flavonoids 981±87##1734±156##864±75##

Fig.3 Protein expression of GRP78，ATF4 and Cx43 in mice heart of each group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)病毒性心肌炎組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重心律失常，而TFA組小鼠心律失常明顯減少，這與本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果相吻合［3］。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明TFA具有明顯抗心律失常作用。本實(shí)驗(yàn)室在以往工作中發(fā)現(xiàn)TFA具有明確的緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用［8-10］，但這種緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用在減少病毒性心肌炎引起的心肌細(xì)胞凋亡作用明顯，是否通過(guò)緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激實(shí)現(xiàn)抗心律失常還不十分明確。為此又對(duì)各組小鼠心肌細(xì)胞檢測(cè)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白

GRP78，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路因子ATF4及縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TFA具有抑制GRP78，ATF4表達(dá)，增加Cx43表達(dá)作用。因此根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)黃芪總黃酮可能通過(guò)緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路因子活化，增加Cx43表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗心律失常作用的，至于這種作用是否還有別的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路因子參與，凋亡是否在其發(fā)揮作用，還需要在以后的實(shí)驗(yàn)中證明。

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