基于反向分子對(duì)接技術(shù)的異鼠李素靶標(biāo)的預(yù)測(cè)Δ

崔明超，陳少軍，崔　文，董　珂，江海龍，周海濱，凌慶枝#（.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥學(xué)院，浙江寧波　500；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京　2006；.青島大學(xué)附屬醫(yī)院嶗山院區(qū)，山東青島　26600；.寧波立華制藥有限公司，浙江寧波　57）

基于反向分子對(duì)接技術(shù)的異鼠李素靶標(biāo)的預(yù)測(cè)Δ

崔明超1，2＊，陳少軍1，崔文3，董珂1，江海龍4，周海濱4，凌慶枝1#（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥學(xué)院，浙江寧波315100；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京210046；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院嶗山院區(qū)，山東青島266003；4.寧波立華制藥有限公司，浙江寧波315174）

目的：利用反向分子對(duì)接技術(shù)對(duì)異鼠李素的潛在靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)。方法：采用idTarget軟件對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中異鼠李素的潛在靶標(biāo)進(jìn)行篩選，利用PyRx 0.8軟件中的autodock vina模塊對(duì)篩選的結(jié)果進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。結(jié)果：異鼠李素與硫氧還蛋白還原酶1、凝血酶、二氫葉酸還原酶、核受體ROR-α等4種靶蛋白的結(jié)合較好，其結(jié)合能（ΔGpred）分別為－11.7、－10.34、－10.11、－10.07 kcal/mol；分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果顯示，異鼠李素與4種靶蛋白核心氨基酸具有靜電作用力、氫鍵、范德華力等相互作用。結(jié)論：硫氧還蛋白還原酶1、凝血酶、二氫葉酸還原酶、核受體ROR-α可能是異鼠李素的潛在靶標(biāo)。

異鼠李素；反向分子對(duì)接；靶蛋白；硫氧還蛋白還原酶1；凝血酶；二氫葉酸還原酶；核受體ROR-α；相互作用

異鼠李素（Isorhamnetin，C12H16O7）是一種黃酮類成分，廣泛存在于白果、車桑仔葉、檉柳、醋柳果、紅車軸草、槐角、黃花蒿、喙果絞股藍(lán)、寬葉香蒲、蒲黃、水芹、狹葉香蒲、茵陳蒿等多種藥用植物之中，研究證實(shí)其具有抗肝毒、抗氧化、抑制脂類過(guò)氧化、抑制血小板聚集等多種作用[1]。浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）傳統(tǒng)習(xí)用其鱗莖，而浙貝母花為浙貝母植物的干燥帶莖梢的花，在臨床上已用于治療咳嗽痰多、支氣管炎等癥[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)浙貝母花含有生物堿、黃酮、揮發(fā)油等成分，而異鼠李素是其中一個(gè)重要的資源性成分[3]。

反向分子對(duì)接技術(shù)是新藥研究開發(fā)中的一種重要手段。其工作原理是以小分子化合物為探針，在已知結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索可能與之相結(jié)合的生物大分子，并通過(guò)能量匹配和空間的調(diào)整形成分子復(fù)合物，進(jìn)而預(yù)測(cè)藥物發(fā)揮作用的靶標(biāo)[4]。因此，一方面，反向分子對(duì)接技術(shù)可以用于研究某些已經(jīng)上市銷售多年的藥物，通過(guò)對(duì)其分子靶標(biāo)進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)，可發(fā)現(xiàn)其新的不良反應(yīng)或者新的臨床應(yīng)用。比如通過(guò)此技術(shù)，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)用來(lái)降膽固醇的他汀類藥物具有抗腫瘤的作用[5]。另一方面，由于從中藥中分離得到的天然產(chǎn)物的作用機(jī)制通常難以闡明，而通過(guò)反向分子對(duì)接，可以發(fā)現(xiàn)其所具有的藥效作用并以此闡明中藥的作用機(jī)制。

筆者以異鼠李素為研究對(duì)象，利用反向分子對(duì)接技術(shù)，以idTarget軟件作為靶標(biāo)的篩選工具，對(duì)異鼠李素與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的潛在靶標(biāo)進(jìn)行篩選、預(yù)測(cè)，并采用PyRx 0.8軟件中的autodock vina模塊進(jìn)行驗(yàn)證。

異鼠李素的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

1　材料與方法

1.1材料

idTarget軟件（http：//idtarget.rcas.sinica.edu.tw/index.php，國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)開發(fā)）；PyRx 0.8軟件（美國(guó)Scripps研究所開發(fā)）；分子模擬圖形界面軟件Discovery Studio Visualizer（DSV）3.5（美國(guó)Accelrys公司）。

圖1　異鼠李素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1　The chemical structure of isorhamnetin

1.2方法

1.2.1idTarget對(duì)靶標(biāo)的預(yù)測(cè)將異鼠李素以Mol2格式（Mol2為一種較為通用的分子結(jié)構(gòu)記錄格式，可以直接從NCBI下載，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/）提交給id-Target服務(wù)器，通過(guò)對(duì)異鼠李素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，產(chǎn)生多種構(gòu)象。選擇全部的7 235種靶蛋白[美國(guó)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank，PDB，http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中包括的靶蛋白種類]進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果按照結(jié)合能[ΔGpred（kcal/mol）]的大小進(jìn)行排序。

1.2.2分子對(duì)接驗(yàn)證對(duì)從結(jié)合能角度分析的結(jié)果，另外從結(jié)合構(gòu)象、親水疏水作用、靜電作用力等多方法進(jìn)行分析驗(yàn)證。因此，在上述篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用PyRx 0.8軟件中的autodock vina模塊，對(duì)潛在的靶標(biāo)分子與異鼠李素進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，并對(duì)復(fù)合物進(jìn)行分析。從靶蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)PDB中下載靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)，然后采用蛋白質(zhì)預(yù)處理工具（http：//dock. cmu.edu.tw/ligand.php）對(duì)靶蛋白進(jìn)行預(yù)處理，得到配體的坐標(biāo)、結(jié)合位置、半徑信息及質(zhì)子化的靶蛋白文件等。在對(duì)接過(guò)程中，以靶蛋白自帶的配體位置為參照，其坐標(biāo)參考蛋白質(zhì)預(yù)處理工具Protein Preparing Tool提供的活性結(jié)合點(diǎn)。完成分子對(duì)接后，用DSV3.5分析靶蛋白與配體形成的復(fù)合物之間的相互作用情況。

2　結(jié)果

2.1基于idTarget的虛擬篩選

利用idTarget對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的7 235種靶蛋白進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接結(jié)果按照ΔGpred的大小從小到大進(jìn)行排序，數(shù)值越低，表明結(jié)合越容易；再通過(guò)檢索治療靶蛋白的專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/tid/）[6]中的數(shù)據(jù)，得到與其相關(guān)的疾病數(shù)據(jù)，結(jié)果見表1（表中略去與疾病無(wú)關(guān)的靶蛋白）。

表1　idTarget篩選出的異鼠李素與疾病相關(guān)的潛在靶標(biāo)Tab 1　Disease-related potential isorhamnetin targets selected by idTarget

2.2基于PyRx 0.8的分子對(duì)接驗(yàn)證

異鼠李素與4種蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合情況的二維圖見圖2（圖中，異鼠李素分子即圖中含有苯環(huán)的分子，蛋白質(zhì)靶標(biāo)即各氨基酸以英文縮寫代替；LYS A∶100表示賴氨酸A鏈的第100位，ASN B∶85表示天冬酰胺B鏈第85位，GLU A∶103表示谷氨酸A鏈第103位；剩余略）；結(jié)合位點(diǎn)坐標(biāo)見表2。

圖2　異鼠李素與4種蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合的二維圖注：Δ，靜電作用力；＊，范德華力；●，氫鍵Fig 2　2D figure for the combination of isorhamnetin and 4 kinds of target proteinsNote：Δ，electrostatic；＊，van der Waals；●，hydrogen bond

表2　異鼠李素與4種靶蛋白結(jié)合位點(diǎn)坐標(biāo)Tab 2　The coordinates of binding sites of isorhamnetin and 4kinds of target proteins

如圖2A所示，異鼠李素與TrxR1（3EAN）存在著氫鍵作用（LYS A∶100，ASN B∶85，ASN D∶129）、范德華力作用（GLU A∶103，色氨酸TRY D∶127，組氨酸HISA∶108）、靜電作用力（絲氨酸SER A∶104，纈氨酸VAL B∶413，蘇氨酸THR B∶412等若干氨基酸）。

如圖2B所示，異鼠李素與凝血酶（2ZO3）存在著靜電作用力（谷氨酰胺GLNA∶41，VALA∶42）。

如圖2C所示，異鼠李素與二氫葉酸還原酶（1S3U）存在著范德華力（亮氨酸LEU A∶22，甘氨酸GLY A∶116，GLY A∶117，GLY A∶17等）和靜電作用力（VAL A∶115，天冬氨酸ASPA∶21，GLUA∶30等）。

如圖2D所示，異鼠李素與核受體ROR-α（1S0X）存在著氫鍵（GLN A∶29，酪氨酸TYR A∶30等）、范德華力（TYR A∶73，LYS A∶66，苯丙氨酸PHE A∶31等）和靜電作用力（ASPA∶21等若干氨基酸）。

從表2可以看出，靶蛋白中存在相應(yīng)的“口袋”與異鼠李素對(duì)接。綜合上述驗(yàn)證結(jié)果，認(rèn)為異鼠李素與靶蛋白存在著結(jié)合的可能性，且此結(jié)果與idTarget篩選的結(jié)果相符合。

3　討論

idTarget軟件是目前包含最新開發(fā)的打分函數(shù)和靶蛋白剖面圖的一款軟件，可在比較精確的格點(diǎn)位置進(jìn)行分子對(duì)接，從而使其預(yù)測(cè)結(jié)果更加可靠[7]。PyRx 0.8則是美國(guó)Scripps研究所開發(fā)的一款三維分子藥物輔助設(shè)計(jì)的免費(fèi)軟件。

反向分子對(duì)接技術(shù)自2001年開始使用以來(lái)，為藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)提供了有力工具。此技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合，用以闡明中藥的多靶標(biāo)特性，并已成為一項(xiàng)熱點(diǎn)研究技術(shù)[8]。如有研究采用虛擬篩選的方法預(yù)測(cè)出姜辣素治療腫瘤的靶標(biāo)可能為白三烯A4水解酶，并得到了試驗(yàn)驗(yàn)證[9]。陳少軍等[10-11]采用此技術(shù)研究丹參中各成分的作用靶標(biāo)，也取得了新進(jìn)展。

3.1異鼠李素相關(guān)靶蛋白研究

虛擬篩選的結(jié)果表明，異鼠李素與腫瘤、血栓、炎癥、血脂類疾病、自身免疫性疾病等密切相關(guān)，TrxR1、凝血酶、二氫葉酸還原酶、核受體ROR-α均為其潛在靶標(biāo)。

TrxR分為TrxR1、TrxR2、TrxR3等3種，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，是一種還原型輔酶Ⅱ（NADPH）依賴的二聚體硒酶[12]。其主要功能是催化NADPH，將硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）上的-S2還原成（-SH）2，以利于保持Trx的還原態(tài)，因此在氧化還原調(diào)節(jié)、抗氧化防御中具有重要作用[13]。TrxR的底物專一性不強(qiáng)，可以還原維生素K3、硫辛酸、二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）和四氧嘧啶、磷脂氫過(guò)氧化物等內(nèi)源性和外源性的物質(zhì)。TrxR1作為3種同工酶之一，主要存在于細(xì)胞漿中，研究認(rèn)為其具有催化氧化還原活性、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)等作用[12]。TrxR在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量是在正常組織中的10倍，可以作為抗腫瘤治療的靶標(biāo)[14]。TrxR與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病也有關(guān)，如Trx系統(tǒng)可以通過(guò)清除自由基而發(fā)揮保護(hù)腦組織的作用[14]。另外，TrxR與自身免疫性疾病也有關(guān)聯(lián)[15]，如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑液及組織中均發(fā)現(xiàn)Trx和TrxR的含量升高，提示TrxR可能與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生有關(guān)[16]。另外TrxR與心肌損傷、某些地方病、獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）、寄生蟲病及染色體異常性疾病的發(fā)生等也有著一定的關(guān)系[12]。

凝血酶主要與各種出血、凝血性的疾病有關(guān)[17]，如血友病、血栓癥等。

二氫葉酸還原酶是生物體內(nèi)很重要的一種酶，其抑制劑有抗癌[18]、抗瘧[19]和抗細(xì)菌感染[20]的作用，廣泛用作癌癥藥物篩選的靶標(biāo)分子和抗感染病的靶標(biāo)分子。對(duì)其作進(jìn)一步研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

核受體ROR-α廣泛分布在機(jī)體各個(gè)組織中，屬于維甲酸相關(guān)的孤核受體亞家族。在胞核中，其在調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄、形態(tài)發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持及高級(jí)神經(jīng)功能控制等方面可發(fā)揮重要的作用。ROR-α也參與生物代謝的調(diào)控，在腫瘤治療[21-22]、生物節(jié)律調(diào)節(jié)[23]、骨代謝障礙治療、免疫功能不全治療、抗炎[24]、抗脂類代謝異常[25]、治療心血管疾病特別是動(dòng)脈粥樣硬化[26]等各個(gè)方面具有積極作用。

3.2異鼠李素的靶標(biāo)預(yù)測(cè)

已經(jīng)有研究表明，異鼠李素具有抗凝血作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明其可以顯著延長(zhǎng)活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）和凝血酶原時(shí)間（PT），顯著抑制凝血酶和人內(nèi)皮細(xì)胞的激活因子X（FXa）的產(chǎn)生；還能延長(zhǎng)出血時(shí)間，抑制Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制因子（PAI-1）誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子α（TNF-α）產(chǎn)生，而此結(jié)果可以為新的抗凝血?jiǎng)┑拈_發(fā)提供依據(jù)[27-28]。但其作用機(jī)制尚不十分清楚，從反向分子對(duì)接的結(jié)果看，凝血酶極有可能是異鼠李素抗凝血作用的靶標(biāo)，值得進(jìn)一步深入研究。

有學(xué)者研究了黃酮類化合物的抗炎作用，發(fā)現(xiàn)在炎癥反應(yīng)中，微生物的產(chǎn)物和炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）生成大量一氧化氮（NO），因此，可抑制NO產(chǎn)生的天然產(chǎn)物則具有抗炎作用。而異鼠李素可以抑制核因子κB（NF-κB）活性、抑制iNOS的活性，因此具有抗炎作用，但是并未發(fā)現(xiàn)其對(duì)巨噬細(xì)胞有活化作用[24]。從對(duì)接結(jié)果分析，核受體ROR-α可能是其發(fā)揮抗炎作用的靶標(biāo)之一。

異鼠李素的抗腫瘤作用也有很多文獻(xiàn)報(bào)道。體外試驗(yàn)證明，在沙棘中提取得到的異鼠李素對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402具有抑制作用，且其細(xì)胞毒性作用呈劑量和時(shí)間依賴性；對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞可通過(guò)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）和P38介導(dǎo)的途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[29]。根據(jù)虛擬篩選結(jié)果推測(cè)，異鼠李素發(fā)揮作用可能是通過(guò)多個(gè)靶標(biāo)發(fā)揮的，比如TrxR1、二氫葉酸還原酶、核受體ROR-α均與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，故其發(fā)揮抗腫瘤作用極有可能是多靶標(biāo)共同作用的結(jié)果。

4　結(jié)語(yǔ)

綜上所述，筆者利用idTarget對(duì)異鼠李素的潛在靶蛋白進(jìn)行了虛擬篩選，然后利用PyRx 0.8軟件中的autodock vina模塊進(jìn)行了分子對(duì)接驗(yàn)證。對(duì)異鼠李素與TrxR1、凝血酶、二氫葉酸還原酶、核受體ROR-α的結(jié)合模式進(jìn)行了分析。分子對(duì)接試驗(yàn)驗(yàn)證反向藥效團(tuán)篩選和分子對(duì)接的結(jié)果具有較好的一致性，且篩選出的靶標(biāo)的作用與異鼠李素的藥理作用和臨床應(yīng)用具有相關(guān)性，說(shuō)明了反向分子對(duì)接技術(shù)對(duì)小分子活性物質(zhì)預(yù)測(cè)的可靠性。

但是基于反向分子對(duì)接技術(shù)靶標(biāo)的預(yù)測(cè)，各類軟件的算法不同，其結(jié)果均存在一定比例的假陽(yáng)性，故需要整合優(yōu)化預(yù)測(cè)模型，以提高虛擬對(duì)接技術(shù)的命中率。另外需要指出的是，計(jì)算機(jī)虛擬對(duì)接的結(jié)果仍需要實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步確證。本文為異鼠李素的靶標(biāo)研究、藥理活性與臨床應(yīng)用研究提供了理論支撐。

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（編輯：劉萍）

Prediction of Isorhamnetin Targets via Reverse Molecular Docking

CUI Mingchao1，2，CHEN Shaojun1，CUI Wen3，DONG Ke1，JIANG Hailong4，ZHOU Haibin4，LING Qingzhi1（1. School of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang Pharmaceutical College，Zhejiang Ningbo 315100，China；2. School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China；3.Laoshan Branch，the Affiliated Hospital of Qingdao University，Shandong Qingdao 266003，China；4.Ningbo Liwah Pharmaceutical Co.，Ltd.，Zhejiang Ningbo 315174，China）

OBJECTIVE：To predict potential isorhamnetin targets via reverse molecular docking.METHOD：idTarget was used to screen potential targets in the database of isorhamnetin and proteins.The autodock vina in PyRx 0.8 was utilized to verify the results after screening via molecular docking.RESULTS：Isorhamnetin was well combined with 4 kinds of target proteins including thioredoxin reductase 1，thrombin，dihydrofolate reductase and nuclear receptor ROR-α，respectively with ΔGpredof－11.7，－10.34，－10.11 and－10.07 kcal/mol.The results of the verification via molecular docking demonstrated electrostatic interaction，hydrogen bonding interaction and van der Waals force between isorhamnetin and the core amino acids of the 4 kinds of target proteins.CONCLUSIONS：Thioredoxin reductase 1，thrombin，dihydrofolate reductase and nuclear receptor ROR-α may be potential isorhamnetin targets.

Isorhamnetin；Reverse molecular docking；Target protein；Thioredoxin reductase 1；Thrombin；Dihydrofolate reductase；Nuclear receptor ROR-α；Interaction

R962

A

1001-0408（2016）28-3921-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.10

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.LY15H280009）；2015年度寧波市第二批科技項(xiàng)目（No.2015A610290）；鄞州區(qū)2015年度第一批農(nóng)社類科技項(xiàng)目（No.鄞科〔2015〕69號(hào)）

＊講師，博士研究生。研究方向：中藥資源開發(fā)。電話：0574-88223287。E-mail：cuimc@mail.zjpc.net.cn

教授，博士。研究方向：生物技術(shù)制藥。E-mail：lingqingzhi@sina.com

（2016-01-05

2016-04-14）