低溫脅迫對胡椒葉片生理生化及顯微結(jié)構(gòu)的影響

伍寶朵　范睿　胡麗松　楊建峰　郝朝運(yùn)

摘 要 以胡椒主栽品種熱引1號胡椒（Piper nigrum c.v. Reyin-1）和野生近緣種石南藤（Piper wallichii）為材料，經(jīng)過4 ℃低溫脅迫處理，研究其在脅迫條件下植株的傷害情況、葉片解剖結(jié)構(gòu)和生理生化指標(biāo)變化。結(jié)果表明：低溫脅迫條件下，石南藤比熱引1號胡椒具有明顯的耐寒表型，胡椒葉片厚度變化與葉片受害程度相一致；脅迫72 h時，熱引1號胡椒保護(hù)酶系統(tǒng)被破壞，石南藤則仍然表現(xiàn)活躍；熱引1號胡椒的可溶性糖和可溶性蛋白含量呈現(xiàn)升降趨勢，石南藤則維持上升；胡椒的丙二醛和脯胺酸含量與其抗寒性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。研究結(jié)果表明，石南藤為抗寒性種質(zhì)，其抗寒性比熱引1號胡椒強(qiáng)，為開展胡椒抗寒育種和胡椒抗寒分子機(jī)理研究提供了材料基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 胡椒；低溫脅迫；生理生化；顯微結(jié)構(gòu)；石南藤

中圖分類號 Q949.732.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Piper nigrum c.v. Reyin-1 and Piper wallichii， treated with 4 ℃ low temperature， were used to study the leaf physiological， biochemical and structural variation. Results showed that the cold resistance of P. wallichii was higher than that of P. nigrum c.v. Reyin-1 based on the phenotype. Leaf thickness variation was consistent with leaf injury. The protection enzyme systems of P. nigrum c.v. Reyin-1 were destroyed， and that of P. wallichii were still active under 4 ℃ for 72 h. The content of soluble sugar and protein of black pepper was positively correlated with cold resistance， while that of malondialdehyde and free proline of black pepper was negatively correlated with cold resistance. It was concluded that the cold resistance of P. wallichii was higher than that of P. nigrum c.v. Reyin-1. These results would provide materials for cold resistant breeding and the molecular mechanism study of pepper cold resistance.

Keywords Piper nigrum； cold stress； physiology and biochemistry； anatomical structure； Piper wallichii

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.008

胡椒（Piper nigurm）為胡椒屬（Piper）多年生常綠藤本植物，素有“香料之王”的美譽(yù)，是世界最重要的香辛料作物[1]。在食品工業(yè)上可用作抗氧化劑、防腐劑和保鮮劑；在醫(yī)藥工業(yè)上可用作健胃劑、解熱劑、利尿劑等；在現(xiàn)代制藥、戒毒和軍事等領(lǐng)域都有廣泛用途[2-5]。目前胡椒種植已遍及亞洲、非洲、拉丁美洲三大洲近20個國家和地區(qū)，據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計，世界胡椒收獲面積近50萬hm2，總產(chǎn)量近45.4萬t。中國胡椒主要分布在海南、云南、廣東、廣西和福建等省區(qū)，種植面積近3萬hm2，年產(chǎn)約3.60萬t，居世界第5位[6]，其中海南是胡椒主產(chǎn)區(qū)，種植面積和產(chǎn)量均占全國90%以上。我國地處熱帶邊緣，胡椒主產(chǎn)區(qū)海南和云南冬季常有低溫危害，我國胡椒主栽品種熱引1號胡椒受寒后易出現(xiàn)落葉、斷枝，甚至死亡的現(xiàn)象，且傷口極易感染病害，易給椒農(nóng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。低溫成為影響我國胡椒豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和制約胡椒產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的重要因素。因此開展胡椒種質(zhì)資源抗寒性鑒定，篩選和培育抗性種質(zhì)（品種）是我國胡椒育種的重要目標(biāo)。

我國胡椒野生近緣種資源豐富，含有許多具有經(jīng)濟(jì)開發(fā)潛力的優(yōu)異資源，為胡椒品種選育和改良提供了重要材料來源[9-13]。石南藤為胡椒科（Piperaceae）胡椒屬多年生藤本植物，在印度東北部常被用的葉和果實(shí)與咖喱一起做調(diào)味品[14]，在中國被作為藥用植物，廣泛用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥、腦梗死以及心絞痛等疾病[15]。石南藤分布在我國甘肅、湖北、湖南、廣西、貴州、云南、四川等省區(qū)，以及尼泊爾、印度、孟加拉國、印度尼西亞[10]，在自然條件下生長緯度較高，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)。

本研究通過開展4 ℃低溫脅迫條件下熱引1號胡椒和石南藤葉片生理生化和顯微結(jié)構(gòu)變化研究，鑒定評價兩份種質(zhì)的抗寒性，為進(jìn)一步研究胡椒抗寒機(jī)理提供依據(jù)，并為胡椒抗寒育種研究提供優(yōu)異基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為熱引1號胡椒和石南藤，其中熱引1號胡椒是我國胡椒主栽品種，來源于從印度尼西亞引進(jìn)的印尼大葉種胡椒（Piper nigrum c.v. Lampong），經(jīng)60多年試種，種植選育而成。石南藤是栽培種胡椒野生近緣種，在我國廣泛分布在甘肅、湖北、四川、廣東、海南等地，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)。供試材料保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所農(nóng)業(yè)部萬寧胡椒種質(zhì)資源圃。熱引1號胡椒和石南藤插條苗按照海南省地方標(biāo)準(zhǔn)“胡椒優(yōu)良種苗培育技術(shù)規(guī)程”（DB46/T26-2012）培育，選取生長正常、無病蟲害和機(jī)械損傷的插條，在溫室沙床中培育生根，生根后轉(zhuǎn)移至育苗袋中撫育3個月，轉(zhuǎn)移至人工氣候箱中進(jìn)行低溫處理。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計 選取長勢良好、生長一致、無病蟲害和機(jī)械損傷的袋裝苗在人工氣候箱（賓德KBWF720，德國）中進(jìn)行低溫脅迫處理，試驗(yàn)設(shè)置4 ℃低溫脅迫，以30 ℃/28 ℃為對照（CK），光照強(qiáng)度為200 μmol/（m2·s），時間設(shè)置為12 h / 12 h，相對濕度保持70%左右，待溫度降至待處理溫度后開始計時。分別在低溫脅迫0、12、24、48、72 h后采集葉片并迅速置于液氮中冷凍，用于測定葉片生理生化變化；以近枝頭端第一個完全穩(wěn)定葉為樣品用FAA固定液固定，制作石蠟切片，用于觀察葉片解剖結(jié)構(gòu)，重復(fù)3次，每次重復(fù)5株苗。

1.2.2 測定方法 采用江蘇科銘生物技術(shù)有限公司測定試劑盒分別測定葉片的POD、CAT、SOD酶活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、丙二醛含量、脯氨酸含量等生理生化指標(biāo)。從第一穩(wěn)定葉中部切取5 mm×5 mm樣品，用FAA固定液固定72 h，在石蠟切片機(jī)（徠卡RM2016，德國）上切片，片厚4 μm，用番紅-固綠染色液染色，最后在Olympus BX51正置顯微鏡下觀察，并使用CCD相機(jī)DP80拍照。測量葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度，每個處理觀察3個切片，每個切片觀察5個視野，并計算平均值[16]。

組織緊密度（CTR）=（柵欄組織厚度/葉片總厚度）×100%

組織疏松度（SR）=（海綿組織厚度/葉片總厚度）×100%

P/I=柵欄組織厚度/海綿組織厚度

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的均值，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多重比較采用Duncan新復(fù)極差法，分別在0.05和0.01水平進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫胡椒植株寒害表現(xiàn)

通過觀察熱引1號胡椒和石南藤表型發(fā)現(xiàn)，CK條件下，熱引1號胡椒和石南藤植株生長正常，葉片形狀和顏色未見明顯變化。4 ℃低溫脅迫條件下，熱引1號胡椒隨脅迫時間延長，植株受害程度越來越嚴(yán)重，脅迫72 h時整株受害嚴(yán)重，葉片受害發(fā)黑，而石南藤植株表型無明顯變化（表1，圖1）。說明4 ℃低溫脅迫條件下，石南藤比熱引1號胡椒具有明顯的耐寒表型。

2.2 低溫脅迫對胡椒葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

4 ℃低溫脅迫處理下胡椒葉片顯微結(jié)構(gòu)變化見圖2和表2。結(jié)果表明，隨脅迫時間延長，熱引1號胡椒葉片厚度越來越小，脅迫72 h的葉片厚度比0 h減少了25.08%，達(dá)到極顯著差異水平；海綿組織和柵欄組織厚度隨脅迫時間延長而降低，其中脅迫12 h后柵欄組織和海綿組織厚度比0 h分別減少了24.55%和10.24%，達(dá)到極顯著差異水平，脅迫24 h后柵欄組織和海綿組織細(xì)胞出現(xiàn)失水變形和排列混亂的現(xiàn)象，邊界不能區(qū)分，脅迫72 h后葉片各組織細(xì)胞都嚴(yán)重失水，結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞變形。石南藤葉片厚度在低溫脅迫后變化不明顯，僅72 h時厚度顯著變??；柵欄組織也有隨脅迫時間延長而降低，其中脅迫24 h和72 h比0 h分別減少了10.43%和5.95%，脅迫72 h后，石南藤下表皮和海綿組織細(xì)胞排列紊亂。說明低溫脅迫后，熱引1號胡椒葉片厚度越來越小，24 h后各組織細(xì)胞寒害癥狀越來越嚴(yán)重，石南藤葉片在72 h后才表現(xiàn)明顯的受害癥狀，葉片厚度變化能夠反映葉片受害程度。

2.3 低溫脅迫對胡椒葉片SOD、CAT、POD活性的影響

4 ℃低溫脅迫處理對胡椒SOD、CAT、POD活性的影響見圖3。由圖3可以看出，4 ℃低溫脅迫后，熱引1號胡椒和石南藤SOD、CAT、POD活性都有顯著上升趨勢。熱引1號胡椒SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，脅迫48 h時達(dá)到最大值，與脅迫0 h相比提高了1.01倍；石南藤SOD活性在脅迫12 h時達(dá)到最大值，與脅迫0 h相比提高了1.36倍，隨脅迫時間延長呈現(xiàn)下降趨勢，脅迫72 h時又呈現(xiàn)上升趨勢。熱引1號胡椒CAT活性

先上升后下降，脅迫24 h時達(dá)到最大值，與脅迫0 h相比提高了1.98倍；而石南藤CAT活性呈現(xiàn)持續(xù)顯著上升趨勢，脅迫72 h達(dá)到最大值，比脅迫0 h提高了2.46倍。熱引1號胡椒POD活性先上升后下降，脅迫24 h時達(dá)到最大值，與脅迫0 h相比提高了5.84倍；石南藤POD活性呈現(xiàn)持續(xù)顯著上升趨勢，脅迫72 h達(dá)到最大值，比脅迫0 h提高了3.62倍。以上結(jié)果說明，與熱引1號胡椒相比，4 ℃低溫脅迫72 h時石南藤SOD、CAT、POD活性都呈現(xiàn)上升趨勢，且石南藤CAT活性顯著高于熱引1號胡椒。

2.4 低溫脅迫對胡椒葉片可溶性蛋白、可溶性糖含量影響

由圖4可知，4 ℃低溫脅迫后，熱引1號胡椒和石南藤可溶性蛋白、可溶性糖含量隨脅迫時間延長都有顯著變化。熱引1號胡椒可溶性蛋白含量先上升后下降趨勢，脅迫48 h時達(dá)到最大值，與脅迫0 h相比提高了2.06倍；石南藤可溶性蛋白含量總體呈現(xiàn)上升趨勢，脅迫48 h時略有下降。熱引1號胡椒可溶性糖含量先上升后下降，脅迫48 h時達(dá)到最大值，與脅迫0 h相比提高了1.55

倍；石南藤可溶性蛋白含量總體呈現(xiàn)上升趨勢，脅迫48 h時略有下降。說明低溫脅迫后，熱引1號胡椒可溶性蛋白和可溶性糖含量均出現(xiàn)不同程度的增加，提高了對膜的保護(hù)作用，但是隨脅迫時間延長，可溶性蛋白和可溶性糖含量均出現(xiàn)下降趨勢；石南藤可溶性蛋白和可溶性糖含量持續(xù)上升，對細(xì)胞膜起到了持續(xù)的保護(hù)作用。

2.5 低溫脅迫對胡椒葉片丙二醛、脯氨酸含量影響

由圖5可知，4 ℃低溫脅迫后，熱引1號胡椒和石南藤的丙二醛、脯氨酸變化差異較大。低溫脅迫后，熱引1號胡椒丙二醛含量先上升后下降，脅迫48 h時達(dá)到最大值，與脅迫0 h相比提高了1.47倍；石南藤的丙二醛含量呈現(xiàn)持續(xù)顯著上升趨勢，脅迫48 h時達(dá)到最大值，比脅迫0 h提高了40%，增幅顯著低于熱引1號胡椒。熱引1號胡椒脯胺酸含量先上升后下降，脅迫48 h時達(dá)到最大值，與脅迫0 h相比提高了1.23倍；石南藤脯胺酸含量略有下降后上升。4 ℃低溫脅迫后，熱引1號胡椒的丙二醛、脯氨酸含量顯著增加，說明其膜脂過氧化程度較高，抗寒性較弱；石南藤的丙二醛、脯氨酸含量增幅不明顯，說明其膜脂過氧化程度較低，抗寒性較強(qiáng)。

3 討論

低溫、干旱等逆境條件下，細(xì)胞質(zhì)膜透性發(fā)生變化，電解質(zhì)外滲，活性氧自由基積累對植物細(xì)胞造成嚴(yán)重傷害，植物體內(nèi)啟動活性氧清除機(jī)制，保護(hù)酶活性增強(qiáng)，防止膜脂過氧化，增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，保護(hù)植物免受傷害。低溫脅迫下，植物SOD活性一般先升后降，表明低溫可以誘導(dǎo)SOD活性升高[17]。熱引1號胡椒SOD活性在10 ℃、8 ℃和6 ℃處理72 h條件下呈持續(xù)上升趨勢，而 4 ℃處理48 h后SOD活性才開始下降，表明4 ℃處理?xiàng)l件下，誘導(dǎo)了胡椒SOD活性升高，隨脅迫時間延長，胡椒植株積累了過多的活性氧，活性氧和防御系統(tǒng)的動態(tài)平衡被破壞，加劇膜脂過氧 化[18-19]。與CAT和POD相比，胡椒SOD防御系統(tǒng)低溫耐受時間更長。石南藤SOD活性表現(xiàn)出升-降-升的趨勢，說明脅迫72 h石南藤SOD活性仍然表現(xiàn)活躍。4 ℃低溫脅迫下，熱引1號胡椒CAT和POD活性都呈現(xiàn)先升后降的趨勢，而石南藤表現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，說明隨脅迫時間延長，4 ℃低溫脅迫72 h熱引1號胡椒保護(hù)酶系統(tǒng)已經(jīng)被破壞，石南藤CAT和POD防御系統(tǒng)在此條件下還能夠表現(xiàn)穩(wěn)定，且活性持續(xù)上升。綜上所述，隨4 ℃脅迫時間延長，熱引1號胡椒SOD、CAT和POD防御系統(tǒng)陸續(xù)被破壞，而石南藤的保護(hù)酶防御系統(tǒng)依然活躍。

可溶性糖和可溶性蛋白都是植物的滲透保護(hù)物質(zhì)，在逆境條件下，通過可溶性糖和可溶性蛋白積累可以增加細(xì)胞液濃度和細(xì)胞持水力，緩解細(xì)胞質(zhì)過度脫水，保護(hù)細(xì)胞質(zhì)不致遇冷凝固。研究表明可溶性糖含量與植物的抗寒性呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系[20-21]，低溫脅迫下，抗寒性越強(qiáng)的品種可溶性糖含量增加的幅度越大，抗寒性越弱的品種可溶性糖含量增加的幅度越小[22-23]。在許多植物中，可溶性蛋白含量與抗寒性呈現(xiàn)正相關(guān)，可能是由于植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成增加或降解減少[21]。油棕、釀酒葡萄、油橄欖等植物的可溶性蛋白含量隨脅迫溫度的降低呈上升趨勢，抗寒性強(qiáng)的品種升高的幅度大[23-25]。本試驗(yàn)表明，低溫脅迫后胡椒的可溶性糖和可溶性蛋白都表現(xiàn)含量上升，隨脅迫時間延長，因種質(zhì)不同而表現(xiàn)不同的升降趨勢?？购詮?qiáng)的石南藤在脅迫24 h后2種物質(zhì)含量沒有明顯的升高，可能因?yàn)槭咸倜{迫初期積累的可溶性糖和可溶性蛋白能夠維持各種正常的功能和代謝；抗寒性弱的熱引1號胡椒在脅迫48 h達(dá)到峰值后兩種物質(zhì)含量出現(xiàn)了劇烈下降，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是低溫脅迫后植物對外界不良環(huán)境做出反應(yīng)，促使可溶性糖含量增加，當(dāng)溫度太低或脅迫時間太長時，細(xì)胞死亡，可溶性糖和可溶性蛋白含量又降低。

低溫脅迫產(chǎn)生大量的活性氧自由基會引起膜脂過氧化，產(chǎn)生大量丙二醛，因此丙二醛含量成為評價生物膜受害程度的重要指標(biāo)之一[26-27]。脯胺酸作為植物最有效的親和性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境條件下可以增強(qiáng)細(xì)胞的持水力，發(fā)揮保護(hù)植物組織的作用[28]。張保青等[29]證明脯氨酸含量的增加是甘蔗對寒冷適應(yīng)的重要生理反應(yīng)。盡管在逆境下脯胺酸對植物具有保護(hù)作用，但其降解過程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)易使植物酶活性降低或完全喪失[21， 30]。翟飛飛等[31]發(fā)現(xiàn)脯胺酸含量與多年生黑麥草抗寒性呈負(fù)相關(guān)，其質(zhì)膜傷害越嚴(yán)重，脯胺酸含量越高。本研究中，從植株表型判定，石南藤抗寒性較強(qiáng)，熱引1號胡椒抗寒性弱；4 ℃低溫脅迫后，熱引1號胡椒丙二醛和脯胺酸含量先上升后下降，而石南藤的丙二醛和脯胺酸含量變化不大。表明胡椒的丙二醛和脯胺酸含量與其抗寒性也呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，抗寒性強(qiáng)的種質(zhì)丙二醛和脯胺酸含量變化不大，抗寒性弱的種質(zhì)丙二醛和脯胺酸含量會顯著增加。

由以上可見，低溫脅迫后，胡椒的SOD、CAT和POD活性，可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛和脯胺酸含量都會出現(xiàn)顯著性變化。抗寒性強(qiáng)的種質(zhì)抗氧化酶活性能夠持續(xù)增加，可溶性糖和可溶性蛋白也呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，而能對植物造成傷害的丙二醛和脯胺酸含量增幅不明顯；在低溫誘導(dǎo)條件下，抗寒性弱的種質(zhì)抗氧化酶活性、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛和脯胺酸含量會出現(xiàn)顯著性增加，隨脅迫時間延長，細(xì)胞死亡，代謝活動和抗氧化酶系統(tǒng)被破壞，出現(xiàn)了顯著下降的趨勢。本研究中抗氧化酶活性和滲透物質(zhì)含量變化規(guī)律為胡椒抗寒分子代謝途徑相關(guān)基因研究提供依據(jù)，并為胡椒開展抗寒育種工作和抗寒分子機(jī)理研究提供材料基礎(chǔ)。

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