垂葉榕癭花發(fā)育特性的初步研究

賈效成　陳良秋

摘 要 研究榕屬植物癭花發(fā)育特性是理解榕樹/榕小蜂協(xié)同進(jìn)化內(nèi)在機(jī)制的重要內(nèi)容。本文解析了垂葉榕隱頭花序伴隨癭花發(fā)育的5個(gè)發(fā)育時(shí)期，采用同工酶電泳的方法比較了癭花與正常雌花同工酶（包括過氧化物酶、過氧化氫酶、淀粉酶和酯酶）譜帶的差異，采用掃描電鏡對(duì)比了癭花壁與授粉后雌花子房壁的差異。結(jié)果表明，癭花被榕小蜂產(chǎn)卵以后，至少啟動(dòng)了一個(gè)與消除過氧化物有關(guān)的酶；而且，癭花子房壁結(jié)構(gòu)疏松，內(nèi)含物小而少，雌花子房壁結(jié)構(gòu)致密且內(nèi)含物多而大，說明癭花發(fā)育所消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大于正常雌花發(fā)育的消耗。研究結(jié)果支持造癭生物匯集營(yíng)養(yǎng)與植物防御行為的互利假說。

關(guān)鍵詞 垂葉榕；癭花；同工酶；協(xié)同進(jìn)化；假說

中圖分類號(hào) Q941 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Fig trees （Ficus spp.； Moraceae） are pollinated by species-specific fig wasps （Agaoninae） and have long been held as the example system of co-evolution. In Ficus benjamina， five development phases of syconia are analyzed. We hope to explore the differences between female flowers and gall flowers. The development of gall flowers is the important key to understand the internal mechanism of fig/fig wasp co-evolution. Using an isozyme electrophoresis and scanning electron microscope， in female flowers and gall flowers， we compared the isozyme （including Amy， Pox， CAT and Est） zymogram. The structure differences in the ovary wall of female flowers and gall flowers were also compared. The result showed that a kind of Pox was activated at least when gall flowers was formed. Moreover， the structure of the ovary wall was loose， the inclusions were small and less； the ovary wall structure of the female flowers was dense， and the inclusions were large and more， indicating that there was more nutrition consumption in the development of gall flowers than that in the seed flowers. Based on these results， we hereby support the mutual benefit hypothesis in the gall-insect mutualism.

Keywords Ficus benjamina； gall flower； isozyme electrophoresis； co-evolution； hypothesis

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.006

?？崎艑僦参铮‵icus spp.）廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)。榕屬植物具有特化的隱頭花序（syconium），通常稱為榕果或隱頭果。隱頭花序頂端由小孔苞片所形成孔道，只在特定時(shí)期讓專一性的榕小蜂（fig wasp）進(jìn)入授粉或提供部分雌花子房供小蜂產(chǎn)卵形成蟲癭，延續(xù)小蜂種群[1-3]。為維持這種互利關(guān)系，榕屬植物及榕小蜂在形態(tài)及結(jié)構(gòu)上高度特化，形成專一性的共生關(guān)系。二者相互依賴，互惠互利，是動(dòng)植物間關(guān)系密切的共生伙伴。榕屬植物與其傳粉昆蟲的這種互利共生關(guān)系，是研究植物和昆蟲協(xié)同進(jìn)化的模式系 統(tǒng)[1-3]。榕屬植物可分為雌雄同株與雌雄異株兩大類。雌雄同株的榕果內(nèi)，雌花一部分被昆蟲產(chǎn)卵發(fā)育為蟲癭，一部分被傳粉而形成種子。雌雄異株的榕果，則有產(chǎn)生種子的雌榕果以及產(chǎn)生花粉與蟲癭的雄榕果之分。Hartley[4]曾比較了癭組織和鄰近正常組織的元素組成及次生代謝物，發(fā)現(xiàn)癭組織具有較低水平的氮化合物和較高水平的酚類化合物。不同造癭者在同一寄主上的造癭組織的化學(xué)組成不同，同一種癭瘤的不同發(fā)育階段癭組織的化學(xué)組成也不同，研究者認(rèn)為造癭者可能產(chǎn)生了某種專一性的活性物質(zhì)，促使癭組織的化學(xué)組成發(fā)生實(shí)時(shí)性的改變。

關(guān)于蟲癭形成的原因和蟲癭與植物的相互關(guān)系，許多學(xué)者提出不同的假說。Price等[5]將這些假說分成六類，分別是：中性共生（neutralism）的非適應(yīng)性假說（nonadaptive hypothesis），屬于植物的防御行為的植物防御假說（plant protection hypothesis），造癭生物匯集營(yíng)養(yǎng)與植物防御行為的互利假說（mutual benefit hypothesis），僅為造癭生物匯集營(yíng)養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)假說（nutrition hypothesis），為躲避環(huán)境逆境的微環(huán)境假說（microenvironment hypothesis），為抵抗和躲避天敵的天敵假說（enemy hypothesis）。這些學(xué)說雖然可解釋一種或幾種類型蟲癭的形成，但總有不完善的地方。這些假說也從另一側(cè)面反映了自然界蟲癭種類的多樣性和復(fù)雜性。國(guó)內(nèi)對(duì)榕屬植物與傳粉榕小蜂、非傳粉小蜂之間的相互關(guān)系及共生維持機(jī)制已經(jīng)開展大量研究[6-8]，但針對(duì)榕屬植物隱頭花序內(nèi)的癭花發(fā)育特性的研究至今報(bào)道較少[9-11]。

垂葉榕是我國(guó)南方常見的雌雄同株榕屬植物，賈效成等[12]已鑒定其在廣州地區(qū)的傳粉小蜂為Eupristina koningsbergeri，3種非傳粉小蜂分別是Epichrysomallinae sycobia sp.、Philotrypesis sp.1和Philotrypesis sp.2。為進(jìn)一步闡明榕/蜂共生的生理生化過程，探索共生過程中的代謝活動(dòng)，尋找隱頭花序內(nèi)榕/蜂共生關(guān)系中的蟲癭形成與一般蟲癭形成的異同點(diǎn)，本研究以垂葉榕為研究對(duì)象，介紹了垂葉榕隱頭花序發(fā)育的5個(gè)時(shí)期，研究了垂葉榕雌花和癭花發(fā)育初期過氧化物酶、過氧化氫酶、淀粉酶和酯酶的譜帶差異，并觀察了二者子房發(fā)育過程中子房壁的結(jié)構(gòu)，旨在對(duì)榕屬植物的癭花發(fā)育特性有新的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步揭示榕樹/榕小蜂協(xié)同進(jìn)化的內(nèi)在機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 以垂葉榕隱頭花序內(nèi)的雌花

和癭花為研究材料。垂葉榕主要分布在華南地區(qū)，為雌雄同株，其專一性的造癭昆蟲是垂葉榕小蜂（Eupristina koningsbergeri），屬膜翅目榕小蜂科（Hymenoptera：Agaonidae），翅膀退化的雄蜂先行羽化，隨即與蟲癭內(nèi)的雌蜂交配后死亡。雌蜂羽化后，沾附花粉飛離榕果，尋找新的處于雌花期的榕果產(chǎn)卵。進(jìn)入新榕果的小蜂可以在短花柱雌花上產(chǎn)卵形成蟲癭（癭花），同時(shí)在長(zhǎng)花柱雌花上傳粉形成種子。在研究隱頭花序發(fā)育時(shí)取自然條件下各時(shí)期的花序，置于體式顯微鏡Olympus（OLYMPUS SZ-CTV）下觀察；在研究癭花與雌花同工酶譜帶時(shí)，在雌前期以80目的塑料網(wǎng)袋套住隱頭花序，在雌花期人工放飛傳粉小蜂進(jìn)入網(wǎng)袋，排除非傳粉小蜂的影響。

1.1.2 樣地和樣株 實(shí)驗(yàn)于2014年8月至2015年10月在中國(guó)科學(xué)院華南植物園（11318E，2306N）實(shí)施。位于廣東省廣州市，海拔20～327 m，年平均氣溫 21.8 ℃， 屬于熱帶亞熱帶氣候。以植物園8株垂葉榕為樣株，觀察取材。

1.2 方法

1.2.1 雌花與癭花的同工酶分析 在間花期取長(zhǎng)花柱雌花和癭花為實(shí)驗(yàn)材料，同工酶分析參照王中仁[13]和孫新立等[14]的方法，并略有改進(jìn)，具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)見表1。

1.2.2 隱頭花序發(fā)育的劃分及拍照 根據(jù)Galil等[3]的方法將榕樹隱頭花序的發(fā)育周期分為5個(gè)時(shí)期。該分期標(biāo)準(zhǔn)被諸多學(xué)者所引用，具有合理性與權(quán)威性，是研究榕屬植物癭花發(fā)育公認(rèn)的尺度。癭花發(fā)育的典型特征于體視顯微鏡（OLYMPUS SZ-CTV）下觀察并拍照（Nikon4500）。

1.2.3 癭花與雌花的掃描電鏡觀察 在間花期取長(zhǎng)花柱雌花和癭花，用2%戊二醛常溫固定4 h后磷酸緩沖液洗滌2 h（每次20 min，換洗6次），1%鋨酸4 ℃固定12 h，2 h洗滌（每次20 min，換洗6次），再用依次30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精系列脫水，臨界點(diǎn)干燥，樣品用醋酸異戊酯處理30 min，樣品常規(guī)方法粘臺(tái)，JFC-1100離子濺射鍍金，JSM-T300掃描電鏡觀察，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 隱頭花序的發(fā)育

如圖1所示，垂葉榕隱頭花序的發(fā)育共分5個(gè)時(shí)期，分別是：（1）雌前期（pre-female phase），花序芽開始發(fā)育并逐漸膨大，直至隱頭花序內(nèi)的雌花具有授粉能力之前。如圖1-A所示，此時(shí)雄花尚未開始發(fā)育，短花柱雌花和長(zhǎng)花柱雌花均已發(fā)育。該發(fā)育階段歷時(shí)較短，僅有3～5 d。（2）雌花期（female phase），從雌花具有授粉能力開始，至雌花接受花粉受精或被榕小蜂產(chǎn)卵。此時(shí)花序口的硬質(zhì)苞片打開，榕小蜂通過花序口鉆入花序腔進(jìn)行產(chǎn)卵和傳粉。此時(shí)長(zhǎng)花柱雌花已經(jīng)被榕小蜂產(chǎn)卵，短花柱雌花已經(jīng)授粉，雄花亦開始發(fā)育， 如圖1-B所示。（3）間花期（interfloral phase），此時(shí)受精或被產(chǎn)卵的雌花子房膨大，開始發(fā)育為種子或孕育榕小蜂幼蟲的癭花（gall flower），雄花繼續(xù)發(fā)育，花序也開始膨大。榕小蜂幼蟲在此期間逐漸發(fā)育直到成熟。如圖1-C所示，該發(fā)育階段歷時(shí)較長(zhǎng)，約3周時(shí)間。（4）雄花期（male phase），花序膨大并開始變的松軟，苞片萎縮使花序通道打開。雄花發(fā)育成熟，花藥開裂散發(fā)花粉。雌、雄榕小蜂由癭花內(nèi)鉆出。如圖1-D所示，該發(fā)育階段較短，1～2 d。（5）花后期（postfloral phase），此時(shí)癭花內(nèi)的榕小蜂已經(jīng)遷飛，種子成熟，雄花凋謝，如圖1-E所示?；ê笃跉v時(shí)也較短，2～4 d。

2.2 雌花與癭花的同工酶譜帶比較

由圖2可以看出，4種同工酶僅有過氧化物酶譜帶清晰明顯，另外4種同工酶均不能跑出清楚的譜帶。在過氧化物酶譜帶中，癭花組織明顯缺少一條小分子的譜帶，證明癭花被榕小蜂產(chǎn)卵以后，至少啟動(dòng)了一個(gè)與消除小分子過氧化物有關(guān)的酶。

2.3 雌花與癭花的形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

如圖3-A、B所示，長(zhǎng)花柱雌花授粉后子房膨大明顯，柱頭呈羽片狀；癭花的子房被榕小蜂

產(chǎn)卵后膨大較小，花柱短而細(xì)，二者區(qū)分明顯。圖3-C、D顯示了雌花和癭花的子房壁整體形態(tài)，其中雌花的子房壁內(nèi)含物明顯較多，造成其切面粗糙；而癭花的子房壁內(nèi)含物較少，其切面光滑，空洞較多。進(jìn)一步放大可見二者切面差異的細(xì)節(jié)，如圖3-E、F箭頭所示，雌花子房壁的細(xì)胞充滿內(nèi)含物，使細(xì)胞充實(shí)飽滿，說明其營(yíng)養(yǎng)充足；癭花子房壁的細(xì)胞內(nèi)含物少而小，細(xì)胞空洞較大，說明其營(yíng)養(yǎng)消耗較大。

3 討論

3.1 宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所揭示的基因表達(dá)差異

Martinson等[9]以巴拿馬的大葉榕（Ficus obtusifolia）為材料，采用宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法研究了雌花和癭花授粉前后的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵前的癭花與授粉前的雌花相比，其與黃酮類及碳水化合物代謝相關(guān)的基因表達(dá)顯著上調(diào)；而產(chǎn)卵24 h后的癭花其與查耳酮合成酶和異構(gòu)酶代謝相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào)。說明在該種雌雄同株榕樹中，靠近花序腔的雌花與遠(yuǎn)離花序腔的雌花在授粉和被產(chǎn)卵前已經(jīng)發(fā)生了功能上的初步分化，二者在雌花期的基因表達(dá)差異顯著，使得榕小蜂傾向于產(chǎn)卵在含黃酮類和碳水化合物物質(zhì)更多的雌花上；產(chǎn)卵后的癭花在卵的刺激下，產(chǎn)生了更多的查耳酮類物質(zhì)，使得癭花開始形成。本研究在間花期取樣，僅關(guān)注了過氧化氫酶、過氧化物酶、酯酶和淀粉酶，此時(shí)傳粉小蜂幼蟲和種子已經(jīng)開始發(fā)育，其營(yíng)養(yǎng)消耗的種類和幅度與上述研究相比已經(jīng)發(fā)生很大變化，如糖類、酯類、黃酮類和查耳酮類物質(zhì)等。另一方面，受上述研究啟發(fā)，在雌花期和間花期初始階段，可以重點(diǎn)分析與碳水化合物代謝、黃酮類代謝和查耳酮代謝相關(guān)酶活性的變化，這需要進(jìn)一步研究。

3.2 雌花與癭花組織的同工酶

植物在逆境條件下正常的氧代謝受阻，體內(nèi)的活性氧含量會(huì)迅速積累，膜脂過氧化作用將導(dǎo)致膜系統(tǒng)受損，引起細(xì)胞膜的通透性增加及電解質(zhì)的滲漏，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織被損壞，使得植物處于一種損傷狀態(tài)[15]。汪少妃等[15]在研究刺桐姬小蜂成癭過程時(shí)發(fā)現(xiàn)，受刺桐姬小蜂危害后受害葉片內(nèi)保護(hù)酶[超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）]活性顯著提高，說明刺桐姬小蜂蟲癭的形成誘導(dǎo)刺桐的保護(hù)酶產(chǎn)生，表現(xiàn)出了明顯的防御反應(yīng)。蟲癭的形成顯著提高了寄主葉片的SOD、CAT、POD、PPO活性；其中SOD、CAT、PPO活性主要體現(xiàn)在蟲癭組織上，開裂期酶活性均達(dá)到最大； PPO活性隨蟲癭發(fā)育不斷增加，而SOD、CAT活性分別在成熟期、成長(zhǎng)分化期都有所下降，POD活性則主要表現(xiàn)在非蟲癭組織上。本研究發(fā)現(xiàn)，雌花與癭花組織中4種同工酶僅有過氧化物酶譜帶清晰明顯，另外3種同工酶均不能跑出清楚的譜帶。對(duì)于刺桐姬小蜂蟲癭形成的研究發(fā)現(xiàn)，在蟲癭的成長(zhǎng)分化期其SOD、CAT、POD、PPO活性的測(cè)定值分別為200～300、15～20、2 500～4 000、50～80 U/mg prot。由此可推測(cè)，在本研究中由于過氧化物酶的含量很高，因此容易跑出清晰的譜帶，而另外一些酶由于含量太少，難以跑出清晰的譜帶。在今后的研究中可以考慮利用比色的方法測(cè)定含量少的酶的活性，這有待于進(jìn)一步研究。

3.3 關(guān)于隱頭花序的發(fā)育

Galil等[3]將榕樹隱頭花序的發(fā)育周期分為5個(gè)時(shí)期，本文對(duì)垂葉榕內(nèi)部雌花和癭花的發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)，垂葉榕的隱頭花序發(fā)育經(jīng)歷5個(gè)明顯的

時(shí)期，這與其余榕屬植物花序的發(fā)育過程相似[16]。花序發(fā)育過程中，雌花、癭花和雄花形態(tài)區(qū)分明顯，尤其是花柱的長(zhǎng)度和花藥，可以作為區(qū)分特征。另外研究中還發(fā)現(xiàn)，一些非傳粉小蜂（non- pollinating wasp）在雌花的子房?jī)?nèi)產(chǎn)卵形成的癭花特別大，如圖1-E所示，最右邊的癭花即為非傳粉小蜂寄生形成的癭花，這可能與其幼蟲體型較大，發(fā)育過程消耗更多的營(yíng)養(yǎng)有關(guān)。由于非傳粉小蜂的種類特別多[17]，產(chǎn)卵的時(shí)間差別很大，產(chǎn)卵的部位多樣，其產(chǎn)卵造成的癭花可能與傳粉小蜂產(chǎn)卵造成的癭花存在很多差異，這需要進(jìn)一步研究。

3.4 造癭昆蟲對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消耗

蟲癭是造癭昆蟲發(fā)育的場(chǎng)所，幼蟲主要有兩種方式獲得植物的營(yíng)養(yǎng)，一種方式是營(yíng)養(yǎng)截取，即在植物正常營(yíng)養(yǎng)流向的通路上攔阻養(yǎng)分；另一個(gè)方式是營(yíng)養(yǎng)匯集，即重新改造植物的營(yíng)養(yǎng)流向，創(chuàng)造新的營(yíng)養(yǎng)匯集庫(kù)，把蟲癭四周的營(yíng)養(yǎng)匯集起來。Wool等[18]以放射線同位素示蹤的方法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)癭綿蚜在黃蓮木屬植物能創(chuàng)造營(yíng)養(yǎng)匯集庫(kù)，且營(yíng)養(yǎng)匯集的強(qiáng)度與造癭昆蟲的種類及蟲癭的類型均有相關(guān)關(guān)系。有些蟲癭所匯集的營(yíng)養(yǎng)從隔壁的芽枝轉(zhuǎn)運(yùn)而來，而有些蟲癭營(yíng)養(yǎng)匯集局限在同枝條的葉片、同葉片的小葉、或僅能獲得同小葉的營(yíng)養(yǎng)。本文研究的蟲癭存在于隱頭花序中，榕小蜂的幼蟲發(fā)育期間引起的營(yíng)養(yǎng)匯集應(yīng)主要來源于隱頭花序，其營(yíng)養(yǎng)是否亦來源于鄰近葉片或鄰近的雌花尚有待于進(jìn)一步研究。

Jansen-Gonzalez等[19]通過組織切片的方法發(fā)現(xiàn)，對(duì)于主動(dòng)傳粉的雌雄同株榕屬植物，其幼蟲發(fā)育的前兩個(gè)階段寄生于子房，而后期則寄生于膨大的胚乳組織。本文的研究表明，在癭花發(fā)育后期，組成癭花的細(xì)胞空洞大而內(nèi)含物少，其營(yíng)養(yǎng)可能用于蟲癭幼蟲發(fā)育。對(duì)于非主動(dòng)傳粉類型及非傳粉小蜂產(chǎn)卵制造的蟲癭，其發(fā)育過程影響因素更多，尚需要進(jìn)一步研究。

汪少妃等[20]研究表面，刺桐姬小蜂蟲癭的結(jié)構(gòu)包括表皮層、保護(hù)層、薄壁層和癭室4部分。其中，表皮層由表皮細(xì)胞和皮層組織構(gòu)成，保護(hù)層主要由綠色的厚壁細(xì)胞以及一些含有液泡的軟組織組成；薄壁層主要由薄壁細(xì)胞組成，且內(nèi)層薄壁細(xì)胞解體，為蟲體發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。蟲癭含有細(xì)胞壁薄而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的組織和大量維管組織，這直接影響了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)生和運(yùn)輸，使得蟲癭成為一個(gè)新營(yíng)養(yǎng)庫(kù)源，可為蟲體生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。本研究通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，在間花期隨著蟲體發(fā)育，癭花壁內(nèi)側(cè)存在大量解體破碎的細(xì)胞，這些細(xì)胞應(yīng)為釋放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后解體的內(nèi)層薄壁細(xì)胞；這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組成和含量變化在癭花的不同發(fā)育階段差別很大，可能以碳水化合物、黃酮類、查耳酮類等為主，這需要進(jìn)一步研究。

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