沉香樣品中曲霉屬真菌菌株HNWSW—20的分離鑒定及其次生代謝產(chǎn)物的研究

鄧加艾　戴好富　王宇光　陳惠琴　譚志瓊　梅文莉

摘 要 本文采用平板分離法從沉香樣品中分離得到一株真菌HNWSW-20，從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)上鑒定其為曲霉菌（Aspergillus sp.），并利用多種色譜技術(shù)對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)鑒定其化合物結(jié)構(gòu)為：2，3-dihydrosorbicillin（1），sorbicillin（2），2，3-二氫-2-（1-丙烯）-6，8-二甲基-7-羥基-色酮（3），鄰苯二甲酸二丁酯（4），7-羥基-異苯并呋喃-1（3H）-酮（5）二十烷酸甲酯（6）；分別采用Ellman比色法和pNPG法測定化合物的乙酰膽堿酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果顯示上述化合物1、2、4具有乙酰膽堿酯酶抑制活性，而化合物1、3、5具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。本文中化合物1～2為首次從曲霉屬中分離得到，并首次報(bào)道具有乙酰膽堿酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。

關(guān)鍵詞 沉香；真菌；分離鑒定；次生代謝產(chǎn)物；生物活性

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The fungus HNWSW-20 from Chinese agarwood was isolated by a plate separation method and identified as Aspergillus sp. by morphology and molecular biology. The secondary metabolites were isolated and purified by various chromatographic technique， and the structures of the compounds were identified as 2，3-dihydrosorbicillin （1）， sorbicillin （2）， （2R）-2，3-dihydro-7-hydroxyl-6，8-dimethyl-2-[（E）-prop-1-enyl] chromen-4-one （3）， dibutylphthalate （4）， 7-hydroxy-1 （3H）-isobenzofuranone （5）， eicosanoic acid （6） on the basis of spectroscopic evidence and physicochemical properties. The acetylcholinesterase and α-glucosidase inhibitory activities of the compounds were determined by Ellman colorimetric assay and pNPG method， respectively. Compounds 1， 2 and 4 showed acetylcholinesterase inhibitory activities， whereas compounds 1， 3 and 5 exhibited α-glucosidase inhibitory activities. In addition， compounds 1–2 were for the first time isolated from Aspergillus sp.， and this was the first report about their acetylcholinesterase and α-glucosidase inhibitory activities.

Keywords Chinese agarwood； fungus； isolation and identification； secondary metabolites； biological activity

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.022

白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]，又名女兒香、莞香、棧香、土沉香等，為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）植物，是我國熱帶、亞熱帶地區(qū)常綠喬木，也是中國沉香唯一的基源植物，主要分布在海南、廣東、福建等地[1]。健康白木香樹不產(chǎn)沉香，而是在自然因素（雷劈、火燒、蟲蛀等）或人為因素（砍傷、打洞、接菌等）損傷或刺激后，經(jīng)過長時(shí)間的反應(yīng)變化，逐漸形成沉香。陶弘景的《名醫(yī)別錄》中有：“沉香、熏陸香、雞舌香、藿香、詹糖香、楓香并微溫。”這是作為藥物的最早記載。沉香性微溫，味辛、苦，歸脾、胃、腎經(jīng)，用于胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急等病癥的治療[2]。沉香燃燒時(shí)散發(fā)出一股清香味，是許多國家的名貴香料，也常被制成手串等工藝品售賣。

有文獻(xiàn)報(bào)道[3]，沉香的形成與真菌有關(guān)，目前已有不少針對(duì)沉香中的真菌進(jìn)行分離和鑒定的研究。傳統(tǒng)的真菌鑒定方法常根據(jù)形態(tài)的描述來確定種屬，這種方法簡單直觀，但不確定因素過多，易干擾菌種的分類鑒定[4]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，分子生物學(xué)也迅猛發(fā)展，核酸序列分析成為真菌鑒定的重要手段。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析法就是最常見的鑒定方法之一。ITS基因是位于真菌核糖體DNA上18S和28S基因之間的區(qū)域片段，主要含有內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）、5.8S rRNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）三個(gè)片段，長度一般在650～750 bp之間[5]。ITS區(qū)域不加入成熟核糖體，所以該片段適應(yīng)性強(qiáng)，能接受更多的變異，進(jìn)化速度較快，具有多態(tài)性特點(diǎn)。5.8S rRNA基因具有高度保守性，存在著廣泛的異種同源性；ITS1和ITS2為中度保守區(qū)，其保守性種內(nèi)幾乎相同而種間差異較大。ITS序列分析可以作為真菌鑒定的重要指標(biāo)[6-8]，結(jié)合形態(tài)特征等，使菌種鑒定更具有科學(xué)性，可信性。

目前，對(duì)于沉香樣品來源的真菌的次生代謝產(chǎn)物研究以發(fā)酵液的抗菌活性為多，對(duì)其中活性化合物的分離鑒定尚不多見。本課題組前期對(duì)奇楠沉香樣品中的真菌進(jìn)行研究，并通過各種色譜和波譜方法對(duì)一株鐮刀菌（Fusarium sp.）進(jìn)行了次生代謝產(chǎn)物的分離鑒定，得到了一系列具有生物活性的化合物[9]。為了廣泛研究沉香來源的不同真菌，分析其次生代謝產(chǎn)物的生物活性，本研究對(duì)白木香所產(chǎn)沉香中的真菌進(jìn)行了分離，其中通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定HNWSW-20為曲霉菌（Aspergillus sp.），進(jìn)而從該菌株的PDB發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物中分離得到了6個(gè)化合物，并對(duì)化合物進(jìn)行了乙酰膽堿酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 供試沉香樣品：購買自廣東省化州市平定縣，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所王軍博士鑒定為廣東白木香所產(chǎn)沉香。

主要試劑：C18反相硅膠和Sephadex LH-20購于Merck公司，乙酰膽堿酯酶、碘化硫代乙酰膽堿、二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）、他克林均購于Sigma公司，α-葡萄糖苷酶購于Solarbio公司；阿卡波糖購于北京百靈威科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，自來水定容至1 000 mL；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，自來水定容至1 000 mL。

1.1.3 儀器與設(shè)備 Autospec300質(zhì)譜與AV-500核磁共振波譜儀，德國Bruker公司；Autopol III型旋光儀，德國Rudolph公司；CA-1111冷卻水循環(huán)裝置與SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，日本EYELA公司；HV-110高壓滅菌器，日本Hirayama公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，美國Thermo Scientific公司；XY-JH-21BC凈化工作臺(tái)，上海昕儀器儀表有限公司；1260分析型HPLC，美國Agilent公司；BP221S萬分之一電子秤，北京賽多利斯天平有限公司；CX31光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 HNWSW-20菌株的分離與鑒定 分離：取沉香塊，用水沖洗后，浸泡于75%酒精2 min，取出，放入0.1%升汞液中浸泡5 min，取出，用無菌水沖洗3～5遍。將最后一次沖洗液涂布在干凈的PDA平板上，作為對(duì)照組以檢驗(yàn)消毒是否徹底。將處理過的沉香塊切成0.5 cm × 0.5 cm的小塊，置于PDA平板上（含0.01%的氯霉素），于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待平板上長出菌落，用平板劃線法和菌絲頂端純化法分離純化菌株。

形態(tài)學(xué)鑒定：將純化后的真菌HNWSW-20劃線接種到PDA培養(yǎng)基上，然后把滅菌的蓋玻片以45度角插入培養(yǎng)基中，放于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 d，等到菌絲體生長出來并附著在蓋玻片上時(shí)，輕輕地拔出蓋玻片，置于顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：提取DNA，以真菌通用引物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG與ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物進(jìn)行純化后，送往生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果提交于NCBI基因庫，進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.2 HNWSW-20菌株發(fā)酵 將真菌HNWSW- 20于PDA平板上進(jìn)行活化后，取1 mm × 1 mm大小的菌塊，放入500 mL的三角瓶（含150 mL PDB培養(yǎng)基）中，于28 ℃，150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d，獲得種子液。取5 mL種子液接種于1 000 mL三角瓶（含400 mL PDB培養(yǎng)基）中，常溫下靜置培養(yǎng)50 d，共發(fā)酵120瓶。

1.2.3 HNWSW-20菌株次生代謝產(chǎn)物的提取與分離純化 將每瓶發(fā)酵液1：1加入乙酸乙酯，混勻，用Bruker FA25勻漿機(jī)破碎菌絲細(xì)胞與孢子，三層紗布過濾，取濾液，用乙酸乙酯1：1萃取三遍，回收合并乙酸乙酯層，減壓濃縮，獲得乙酸乙酯提取物（37.0 g）。

將乙酸乙酯提取物經(jīng)過減壓硅膠柱色譜，以石油醚-氯仿、氯仿-甲醇為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，得到13個(gè)流份（Fr.1～Fr.13）。Fr.4（126.0 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離（流動(dòng)相為甲醇），得到Fr.4-1和Fr.4-2兩個(gè)流份。Fr.4-1（110.5 mg）再經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱色譜洗脫（流動(dòng)相為氯仿-甲醇，體積比為1：1），再經(jīng)半制備HPLC分離（流動(dòng)相為甲醇-水，體積比為70：30），得到化合物4（8.1 mg）。Fr.4-2（12.0 mg）經(jīng)半制備HPLC分離（流動(dòng)相為甲醇-水，體積比為70：30），得到化合物1（4.2 mg）。Fr.5（1.0 g）以甲醇-水為流動(dòng)相，經(jīng)C18柱色譜梯度洗脫，得到9個(gè)流份（Fr.5-1～Fr.5-9）。Fr.5-2（9.2 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離（流動(dòng)相為氯仿-甲醇，體積比為1：1），得到Fr.5-2-1和Fr.5-2-2兩個(gè)流份。Fr.5-2-2（5.2 mg）經(jīng)半制備HPLC分離（流動(dòng)相為甲醇-水，體積比為25：75），得到化合物5（1.2 mg）。Fr.5-4經(jīng)半制備HPLC分離（流動(dòng)相為甲醇-水，體積比為60：40），得到化合物3（5.2 mg）。Fr.5-6經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離（流動(dòng)相為氯仿-甲醇，體積比為1：1），得到化合物2（4.0 mg）。Fr.5-9以石油醚-氯仿為流動(dòng)相梯度洗脫，經(jīng)硅膠柱色譜分離，得到化合物6（43.5 mg）。

1.2.4 生物活性測試 乙酰膽堿酯酶抑制活性測試：使用Ellman等[10]的方法測定化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性，DMSO為溶劑，他克林為陽性對(duì)照，陰性對(duì)照為DMSO。計(jì)算公式如下：

抑制率= （A0–A1）/A0，

式中，A0表示陰性對(duì)照平均吸光值，A1表示待測樣品的平均吸光值。

α-葡萄糖苷酶抑制活性測試：根據(jù)Jong- Anurakkun等[11]報(bào)道的pNPG（4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷）法對(duì)化合物進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性的評(píng)價(jià)。以阿卡波糖溶液為陽性對(duì)照，DMSO-PBS溶液（10%）為陰性對(duì)照。計(jì)算公式如下：

抑制率= [（B1–B0） –（A1–A0）]/（B1–B0）×100%

式中，A0表示背景對(duì)照組吸光值，A1表示實(shí)驗(yàn)組吸光值，B0表示空白對(duì)照組吸光值，B1表示陰性對(duì)照組吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌HNWSW-20的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：PDA培養(yǎng)基上菌落呈圓形，中間略凸，初為白色，后漸變?yōu)榘拙G色，菌落反面為淡黃色。分生孢子梗細(xì)長，頂端膨大形成球狀頂囊，分生孢子為球形，于頂囊處呈串狀生長。菌株HNWSW-20的形態(tài)學(xué)特征與文獻(xiàn)[7]中關(guān)于曲霉屬（Aspergillus sp.）的形態(tài)描述相似。

分子生物學(xué)鑒定：所得序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)后，用MEGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。結(jié)果顯示，HNWSW-20菌株與曲霉菌最為接近，且其與煙曲霉（Aspergillus fumigatus）DYJ1（1）菌株（登錄號(hào)為KM268635）同源性高達(dá)100%。

綜合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的結(jié)果，將HNWSW- 20菌株鑒定為曲霉屬（Aspergillus sp.）菌株。

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，ESI-MS在m/z 233處給出[M-H]-峰，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)推斷其分子式為C14H18O3。1H-NMR （CD3OD， 500 MHz） δH： 7.44 （1H， s， H-6）， 5.48 （2H， m， H-4'， 5'）， 2.94 （2H， t， J = 7.5 Hz， H2-2'）， 2.34 （2H， m， H2-3'）， 2.14 （3H， s， H3-8）， 2.04 （3H， s， H3-7）， 1.61 （3H， m， H3-6'）； 13C-NMR （CD3OD， 125 MHz） δC： 206.0 （C-1'）， 162.5 （C-2）， 162.0 （C-4）， 131.0 （C -4'）， 130.4 （C-6）， 126.8 （C-5'）， 117.2 （C-5）， 113.4 （C-3）， 111.9 （C-1）， 38.7 （C-2'）， 29.0 （C-3'）， 18.1 （C-6'）， 16.4 （C-8）， 8.0 （C-7）。以上數(shù)據(jù)與范國濤[12]報(bào)道的化合物2'，3'-dihydrosorbicillin的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物1為2'，3'-dihydrosorbicillin。

化合物2：黃色粉末，ESI-MS在m/z 231處給出[M-H]-峰，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)推斷其分子式為C14H16O3。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δH： 13.58 （1H， s， 2-OH）， 7.46 （1H， dd， J = 14.7， 10.6 Hz， H-3'）， 7.44 （1H， s， H-6）， 7.44 （1H， s， H-6）， 6.94 （1H， s， H-2'）， 6.31 （2H， m， H-4'， 5'）， 2.22 （3H， s， H3-8）， 2.14 （3H， s， H3-7）， 1.91 （3H， d， J = 6.4 Hz， H3-6'）； 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC： 192.7 （C-1'）， 162.7 （C-2）， 158.7 （C-4）， 144.6 （C-3'）， 141.3 （C-5'）， 131.0 （C-4'）， 128.9 （C-6）， 122.0 （C-2'）， 114.5 （C-5）， 113.7 （C-3）， 110.5 （C-1）， 19.1 （C-6'）， 15.8 （C-8）， 7.7 （C-7）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)分析，結(jié)合文獻(xiàn)[13]，化合物2被鑒定為sorbicillin。

化合物3：無色粉末，[α]20 D = -20.4 （c 0.26， MeOH）；ESI-MS在m/z 255處給出[M+Na]+峰，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)推斷其分子式為C14H16O3。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δH： 7.56 （1H， s， H-2）， 5.87 （1H， dq， J = 15.4， 6.5 Hz， H-5'）， 5.70 （1H， ddd， J = 15.4， 6.3 Hz， 1.5 Hz， H-4'）， 4.85 （1H， m， H-3'）， 2.69 （2H， m， H-2'）， 2.20 （3H， s， H-7）， 2.13 （3H， s， H-8）， 1.77 （3H， d， J = 6.5 Hz， H-6'）； 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC： 191.9 （C-1'）， 159.6 （C-6）， 158.9 （C-4）， 129.9 （C-5'）， 129.0 （C-4'）， 125.9 （C-2）， 117.3 （C-3）， 114.6 （C-1）， 110.7 （C-5）， 78.3 （C-3'）， 42.8 （C-2'）， 18.0 （C-6'）， 15.5 （C-7）， 8.2 （C-8）。以上數(shù)據(jù)與Ying等[14]報(bào)道的化合物2的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物3為2，3-二氫-2-（1-丙烯）-6，8-二甲基-7-羥基-色酮。

化合物4：無色油狀，ESI-MS在m/z 279處給出[M+H]+峰，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)推斷其分子式為C16H22O4。1H-NMR （CD3OD， 500 MHz） δH： 7.72 （2H， dd， J = 5.7， 3.3 Hz， H-3， 6）， 7.61 （2H， dd， J = 5.7， 5.7 Hz， H-4， 5）， 4.29 （4H， t， J = 6.6 Hz， H-8， 8'）， 1.72 （4H， dt， J = 6.6， 14.5 Hz， H-9， 9'）， 1.45 （4H， m， H-10， 10'）， 0.98 （6H， t， J = 7.4 Hz， H-11， 11'）； 13C-NMR （CD3OD， 125 MHz） δC： 169.3 （C-7， 7'）， 133.6 （C-1， 2）， 132.3 （C-4， 5）， 129.9 （C-3， 6）， 66.6 （C-8， 8'）， 31.7 （C-9， 9'）， 20.3 （C-10， 10'）， 14.0 （C-11， 11'）。以上數(shù)據(jù)與曹煦等[15]報(bào)道的化合物5的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物4為鄰苯二甲酸二丁酯。

化合物5：白色粉末，ESI-MS在m/z 173處給出[M+Na]+峰，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)推斷其分子式為C8H6O3。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δH： 7.57 （1H， t， J = 7.8 Hz， H-5）， 6.98 （1H， d， J = 7.8 Hz， H-4）， 6.94 （1H， d， J = 7.8 Hz， H-6）， 5.33 （2H， s， H2-3）； 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC： 172.7 （C-1）， 156.6 （C-7'）， 146.7 （C-7）， 137.0 （C-5）， 115.3 （C-4）， 113.4 （C-6）， 110.9 （C-3'）， 70.7 （C-3）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)析，結(jié)合文獻(xiàn)[16]，化合物5被鑒定為7-羥基-異苯并呋喃-1（3H）-酮。

化合物6：白色固體，在m/z 255處給出[M+Na]+峰，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)推斷其分子式為C21H42O2。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δH： 3.64 （3H， s， H3-21）， 2.28 （2H， t， J = 7.6 Hz， H-2）， 1.59 （2H， m， H-3）， 1.29 （32H， m， H-4～H-19）， 0.86 （3H， t， J = 6.9 Hz， H-20）； 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC： 174.37 （C-1）， 51.5 （C-21）， 34.2 （C-2）， 32.0 （C-18）， 28.8～29.8 （C-4～C-17）， 25.1 （C-3）， 22.8 （C-19）， 14.2 （C-20）。以上數(shù)據(jù)與朱少暉等[17]報(bào)道的二十烷酸甲酯的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物6為二十烷酸甲酯。

2.3 生物活性測試結(jié)果

2.3.1 乙酰膽堿酯酶抑制活性 化合物1～4乙酰膽堿酯酶抑制活性結(jié)果如表1所示。其中化合物1～3為首次檢測乙酰膽堿酯酶抑制活性。從表中可以看出，化合物1、2、4具有較弱的乙酰膽堿酯酶抑制活性，化合物3未檢測到乙酰膽堿酯酶抑制活性。

2.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性 化合物1～5 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性結(jié)果如表2所示。其中化合物1～3為首次檢測α-葡萄糖苷酶抑制活性。從表中可以看出，化合物1、3具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其活性比陽性對(duì)照他克林略高，化合物5具有微弱的α-葡萄糖苷酶抑制活性，化合物2、4未檢測到α-葡萄糖苷酶抑制活性。

3 討論

本研究從沉香中分離純化得到一株真菌HNWSW-20，鑒定為曲霉菌（Aspergillus sp.）。并對(duì)其PDB發(fā)酵后的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，共得到6個(gè)化合物，根據(jù)波譜數(shù)據(jù)分析，分別鑒定為2，3-dihydrosorbicillin（1），sorbicillin（2），2，3-二氫-2-（1-丙烯）-6，8-二甲基-7-羥基-色酮（3），鄰苯二甲酸二丁酯（4），7-羥基-異苯并呋喃-1（3H）-酮（5），二十烷酸甲酯（6），其中化合物1～2為首次從曲霉屬中分離得到。

化合物1～3為首次檢測乙酰膽堿酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。α-葡萄糖苷酶可限制或延緩糖在消化道內(nèi)分解，α-葡萄糖苷酶抑制劑是Ⅱ型糖尿病降糖藥之一，在臨床上廣泛使

用[18]。本研究中化合物1、3具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其活性比陽性對(duì)照他克林略高，化合物5具有弱的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可為研制新的α-葡萄糖苷酶抑制劑提供思考線索。此外化合物1、2、4具有弱的乙酰膽堿酯酶抑制活性。

有學(xué)者認(rèn)為沉香的形成是由于其基源植物受傷后經(jīng)微生物侵染，出現(xiàn)一系列病理癥狀，植株經(jīng)過刺激反應(yīng)，逐漸分泌防御性樹脂形成沉香。張秀環(huán)等[19]證明白木香健康部位和樹脂形成部位的內(nèi)生真菌優(yōu)勢種群不同，分別為枝頂孢霉屬（Acremonium sp.）和青霉屬（Penicillium sp.）。馬華明[20]通過實(shí)驗(yàn)表明沉香始形成和已形成兩階段的菌種相似，以可可毛殼色單隔孢（Lasiodiplodia theobromae）等致病菌為主，但與沉香未形成階段分離到的菌種有很大差異。更有研究[21]證明多變根毛霉（Rhizomucor variabilis）、再育鐮刀菌（Fusarium proliferatum）和哈茨木霉（Trichoderma harzii）能促進(jìn)沉香的形成。由此說明，沉香結(jié)香與真菌存在一定相關(guān)性。沉香中富含色酮類化合物[22-24]，本研究所分離得到的化合物1～5均帶有苯環(huán)，且化合物1～3為結(jié)構(gòu)相似的系列化合物，化合物3成環(huán)后形成了色酮的母核結(jié)構(gòu)。本菌株的次生代謝產(chǎn)物與沉香中色酮衍生物的形成是否具有相關(guān)性，還有待進(jìn)一步研究。

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