黃皮白肉火龍果快繁體系的建立

李羽佳 唐文 魏卿 林妃 李凱 金志強(qiáng)

摘 要 黃皮白肉火龍果，又名麒麟果，為建立其快繁體系，本研究選取種子萌發(fā)長出的莖段為外植體，研究其不同消毒時(shí)間、不同濃度激素配比對(duì)其愈傷組織及芽的誘導(dǎo)、增殖繼代、根生長的影響。結(jié)果表明：用無水乙醇滅菌40 s后，再用5%次氯酸鈉溶液滅菌10 min，種子萌發(fā)率最高可達(dá)97%。愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基最佳配方為1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，芽的誘導(dǎo)率最高可達(dá)97%；利用MS+2.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L NAA培養(yǎng)基進(jìn)行增殖、繼代培養(yǎng)的效果最佳，增值系數(shù)最高為4.6；在MS培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L IBA，可最大程度地促進(jìn)根的生長。

關(guān)鍵詞 火龍果；組織培養(yǎng)；萌發(fā)率

中圖分類號(hào) S682.33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Selenicereus megalanthus is also known as yellow pitahaya. In order to establish a system of Selenicereus megalanthus tissue culture and rapid propagation， seed germination stem segments were used as the explants， and the effects of different disinfection time， different concentrations of hormones were studied on the callus germination， propagation， and the growth of the root. The result indicated that the germination rate was 97% by sterilization with pure ethanol in 40 s， 5% hypochlorite in 10min. The suitable medium for callus germination was 1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA， and the germination rate was 97%； The best medium for proliferation was MS+2.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L NAA， and the proliferation coefficient was 4.6； The best medium for rooting was MS+2.0 mg/L IBA.

Key words Selenicereus megalanthus； tissue culture； germination rate

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.016

火龍果（Hylocereus undnlates Britt. & Rose），又名仙蜜果或紅龍果，其營養(yǎng)豐富、畏寒耐旱[1-3]，大部分屬于仙人掌科量天尺屬[Hylocereus （Berger）Britt.et Rose]，小部分屬于蛇鞭柱屬（Seleniereus meja-lantous）[4]。大體上可分為紅皮紅肉、紅皮白肉、黃皮白肉等3種類型。黃皮白肉種[S.megalanthus （K.schumann ex Vaupel） Ralf Bauer]火龍果是近幾年新興的品種，又名麒麟果，原產(chǎn)于中美洲。其果實(shí)較小，種子較大，無果腥味，果實(shí)甜度高達(dá)18度以上，富含豐富的花青素和一般植物少有的水溶性膳食纖維，又因其品質(zhì)優(yōu)良、產(chǎn)量小等特點(diǎn)，致其經(jīng)濟(jì)價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他類型火龍果。近年來，關(guān)于火龍果的研究主要集中在種植資源引進(jìn)、栽培及生物學(xué)特性、貯藏保鮮技術(shù)、色素提取等方面，對(duì)火龍果分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、植物病害等方面的研究相對(duì)較少，而有關(guān)火龍果的新品種選育、采后生理、產(chǎn)品加工及需肥特性等方面的研究相當(dāng)有限[5-7]。植物組織培養(yǎng)具有栽培條件可人為控制、成長周期短、增值率高、管理方便、利于工廠化生產(chǎn)等特點(diǎn)，可快速獲得優(yōu)質(zhì)、生長均一、低毒、形狀穩(wěn)定的植物幼苗，且在分子育種、植物抗性分析等研究方面具有重要作用?；瘕埞旆斌w系研究多采用莖段、實(shí)生幼苗、花藥[8]等為外植體，近年來，又開展了針對(duì)特定品種火龍果組織培養(yǎng)方面的研究[9-10]。

建立黃皮白肉火龍果快繁體系是解決生產(chǎn)中單果體積小、產(chǎn)量低、掛果時(shí)間長、種苗稀缺且實(shí)生苗性質(zhì)不穩(wěn)定等問題的關(guān)鍵，是改變國內(nèi)黃皮白肉火龍果稀缺、無法形成種植產(chǎn)業(yè)化等現(xiàn)狀的根本途徑。鑒于此，本研究選用實(shí)生莖段為外植體建立快繁體系，為火龍果新品種選育、微嫁接技術(shù)的應(yīng)用與推廣、黃皮白肉火龍果工廠化生產(chǎn)及火龍果產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試所用黃皮白肉火龍果種子來自于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院組培廠。選擇播種一個(gè)月后生長均一健康的莖段作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體的選取及消毒處理 選取高度成熟的黃皮白肉火龍果種子，先用流水清洗干凈雜質(zhì)，接著用75%無水乙醇分別浸泡20 s、40 s、1 min，然后用無菌水清洗3～5次，再使用5%次氯酸鈉溶液消毒5、10、15 min，最后用無菌水清洗3～5次。清洗干凈后晾干，接種于MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理播種10瓶，每瓶接種10顆種子，先暗培養(yǎng)10 d，當(dāng)種子發(fā)芽后立刻移至溫度（25±2）℃、每天在光照12 h下繼續(xù)培養(yǎng)20 d，當(dāng)幼苗生長至1.5～2 cm時(shí)備用。

1.2.2 愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 切去幼苗根部及子葉部分，將幼莖切成1 cm左右莖段并垂直接種于培養(yǎng)基上。以MS、1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后分別添加NAA（濃度為0.5、1.0、1.5 mg/L）、6-BA（濃度為1、2、3 mg/L）、瓊脂10 g/L、蔗糖30 g/L，培養(yǎng)基pH值為5.9。每個(gè)編號(hào)培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種4段莖段。將莖段置于溫度（25±2）℃、光照12 h/d、光照強(qiáng)度1 500～1 800 lx環(huán)境中培養(yǎng)30 d，最后統(tǒng)計(jì)愈傷組織數(shù)及不定芽的誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率=愈傷組織數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.2.3 增殖繼代培養(yǎng) 當(dāng)幼芽長至1～1.5 cm時(shí)切除愈傷組織部分，將其切成1 cm左右的莖段接種于增殖培養(yǎng)基中，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加6-BA（濃度為1、2、3 mg/L）、NAA（濃度為1、2、3、4mg/L），再添加瓊脂10 g/L、蔗糖30 g/L，培養(yǎng)基pH值為5.9。每個(gè)編號(hào)培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種4段莖段，在溫度（25±2）℃、光照16 h/d、光照強(qiáng)度1 500～1 800 lx環(huán)境中培養(yǎng)20 d后，最后統(tǒng)計(jì)增殖率。增值率=形成的有效苗數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.2.4 生根培養(yǎng) 當(dāng)幼芽生長到3～4 cm時(shí)，將芽體切下，放置于MS培養(yǎng)基中， 分別添加濃度為0.5、1、2、3 mg/L IBA，再添加瓊脂10 g/L、蔗糖30 g/L，培養(yǎng)基pH值為5.9。每個(gè)編號(hào)培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶接種1個(gè)幼芽，于溫度（25±2）℃、光照12 h/d、光照強(qiáng)度1 500～1 800 lx環(huán)境中培養(yǎng)20 d，最后統(tǒng)計(jì)生根率。生根率=幼苗生根數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)處理重復(fù)3次，并采用DPS（Date Processing System）軟件對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體選取及消毒處理

由表1可知，當(dāng)無水乙醇滅菌時(shí)間為20 s時(shí)，發(fā)芽率隨次氯酸鈉濃度的升高而升高；當(dāng)無水乙醇滅菌時(shí)間為40 s時(shí)，染菌數(shù)基本為0；當(dāng)次氯酸鈉消毒時(shí)間為10 min時(shí)，發(fā)芽率最高；當(dāng)無水乙醇滅菌時(shí)間為60 s時(shí)，染菌數(shù)依然為0，但發(fā)芽率很低。綜上所述，處理5即無水乙醇滅菌40 s、5%次氯酸鈉溶液滅菌10 min時(shí)，發(fā)芽率最高為97%，因此可將此處理作為最佳處理方案。

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

由表2可知，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的處理中，愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)率均低于1/2 MS培養(yǎng)基。誘導(dǎo)率隨NAA濃度的升高而升高，當(dāng)NAA濃度為1.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率最高，繼續(xù)升高濃度時(shí)愈傷組織褐變率升高。而當(dāng)NAA濃度不變、6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率高于其他處理。綜上所述，最佳激素濃度組合為1/2 MS+1.0 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA。

2.3 增殖繼代培養(yǎng)

由表3可知，增值系數(shù)隨6-BA濃度的升高而升高，當(dāng)濃度為3.0mg/L時(shí)增值率不再升高，與濃度為2.0 mg/L時(shí)基本相同，且增殖芽體明顯比濃度為2.0 mg/L時(shí)長勢(shì)弱。當(dāng)NAA濃度為3.0 mg/L時(shí)，增值系數(shù)最高，且生長耗時(shí)短長勢(shì)旺（圖1）。綜上所述，最佳增值培養(yǎng)基為：MS+2.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L NAA+10 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖，pH值為5.9。

2.4 生根培養(yǎng)

由表4可知，每個(gè)處理均可生根，且生根數(shù)隨IBA濃度的增加而增加，當(dāng)IBA濃度為2.0 mg/L時(shí)，生根數(shù)最多（圖2）；當(dāng)IBA濃度為3.0 mg/L時(shí)，根變瘦弱并有氣生根生成。綜上所述，最佳配方為：MS+2.0 mg/L IBA。

3 討論

利用無菌種胚所發(fā)幼芽作為外植體，成功的避免了成熟莖段做為外植體易帶菌、易污染等缺點(diǎn)，且具有再生能力強(qiáng)、長勢(shì)均一等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。本研究當(dāng)無水乙醇消毒時(shí)間為20 s時(shí)，消毒時(shí)間過短，種子發(fā)芽易染菌；當(dāng)消毒時(shí)間為60 s時(shí)，種子發(fā)芽率大幅降低，可能由于無水乙醇對(duì)種子造成了毒害，或抑制了種胚正常的新陳代謝和細(xì)胞分裂。而當(dāng)無水乙醇消毒時(shí)間相同次氯酸鈉消毒時(shí)間變化時(shí)，發(fā)芽率變化并不大，這說明影響種子消毒的主要因素為無水乙醇消毒處理，而最佳的處理時(shí)間為無水乙醇消毒40 s，5%次氯酸鈉消毒20 min。

在試驗(yàn)中使用不同劑量、不同種類生長素和細(xì)胞分裂素是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵[12-14]。本研究利用不同濃度6-BA、NAA及IBA建立了黃皮白肉火龍果的快繁體系，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，誘導(dǎo)率可達(dá)97%。在前人研究中，火龍果外植體誘導(dǎo)多運(yùn)用激素NAA及6-BA完成，少部分研究使用ZT與IBA。王云山等[15]、洪青梅等[16]選用“金都一號(hào)”等品種帶刺座莖段為外植體，使用4.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA對(duì)火龍果進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率分別為75%、80%。這可能由于不同供試材料及外植體的選擇導(dǎo)致了結(jié)果出現(xiàn)差異[17]。本研究以MS+2.0 mg/L 6-BA +3.0 mg/L NAA培養(yǎng)不定芽，芽的增值系數(shù)最高為4.6。而張嶺等[18]以MS+9.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA為增值培養(yǎng)基，其增值系數(shù)最高可達(dá)12，這可能還與繼代時(shí)間、繼代次數(shù)、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。

黃皮白肉火龍果為新興品種，學(xué)者對(duì)其研究較少，相比于紅皮紅肉、紅皮白肉等品種在外觀形態(tài)及生理特性上均存在一定的差距[19-20]。洪青梅等[16]、黃春華等[21]、劉小翠等[9]利用“金都一號(hào)”、“蜜寶”、“貴州B7”3個(gè)不同品種分別建立了火龍果快繁體系，在激素的運(yùn)用及配比、誘導(dǎo)率及增值率等方面皆與本研究不盡相同。本研究建立了黃皮白肉火龍果的快繁體系，解決了種苗稀缺及植株易染病等問題，但從組培苗生長成苗仍需很長一段時(shí)間，如何減少時(shí)間成本、保證其遺傳穩(wěn)定性等問題仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Thomson P. Pitahaya（Hylocereus species）： a promising new fruit crop for southern California[M]. Bonsall：Bonsall Publications，2002.

[2] 高國麗，張冰雪，喬 光 ，等. 火龍果種質(zhì)資源的耐寒性綜合評(píng)價(jià)[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2014，33（3）：26-32.

[3] 鄧仁菊，范建新，王 彬，等. 火龍果抗寒性檢測(cè)初探[J]. 植物生理學(xué)通訊，2009，45（10）：1 023-1 026.

[4] Lichtenzveig J，Abbo S，Nerd A，et al. Cytology and mating systems in the climbing cacti Hylocereus and Selenicereus[J]. American Journal of Botany，2000，87（7）：1 058-1 065.

[5] 陳 杰，龐江琳，李尚德，等. 火龍果的微量元素含量分析[J]. 廣東微量元素科學(xué)，2004，11（5）：56-57.

[6] Jamiilah B，Shu C E，Kharidah M. Physico-chemical characteristics of red pitaya （Hylocereus polyrhizus） peel[J]. International Food Research Journal，2011，18（2）：279-286.

[7] 鄧仁菊，范建新，蔡永強(qiáng). 國內(nèi)外火龍果研究進(jìn)展及產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：188-192.

[8] 范建新，鄧仁菊，王永清，等. 火龍果花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)胚性愈傷組織及遺傳穩(wěn)定性[J]. 分子植物育種，2017，15（1）：258-266

[9] 劉曉翠，文曉鵬，夏道強(qiáng)，等. 貴州優(yōu)異白肉火龍果B7的離題快繁技術(shù)研究[J]. 種子生產(chǎn)，2017，1（36）：121-124

[10] 謝志亮，吳振旺，增光輝. 白玉龍火龍果成熟種子無菌萌發(fā)及組培技術(shù)研究[J]. 中國南方果樹，2016，45（1）：58-61.

[11] 鄭思成，文曉鵬. 火龍果種胚的無菌快速催芽技術(shù)[J]. 種子，2011，30（7）：76-78.

[12] Hao Y J，Deng X X. Cytological and molecular evaluation of strawberry plants recovered from in vitro conservation by slow-growth[J]. Jouranl of Horticultural Science & Biotechnology，2005，80（5）：588-592.

[13] 鄒 娜，陳 璋，林思祖，等. 福建山櫻花愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27（10）：1 417-1 423.

[14] Mohamed Y Y. Micropropagation of pitaya （Hylocereusundatus britt on et rose）[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2002，38（5）：427-429.

[15] 王云山，周美虹，康黎芳，等. 火龍果莖段組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（5）：455-458.

[16] 洪青梅，胡文斌，李洪立，等. ‘金都一號(hào)火龍果組織培養(yǎng)之外植體處理優(yōu)化及不定芽誘導(dǎo)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2017，38（11）：2 119-2 123.

[17] 彭綠春，瞿素萍，蘇 艷，等. 火龍果兩步法組培苗快繁技術(shù)研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2014，27（6）：2 529-2 533.

[18] 張 領(lǐng)，趙左敏，陳紅艷，等，火龍果離體快繁與組培苗移植馴化技術(shù)[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué). 2016，44（2）：20-23.

[19] 葛 宇，魏 卿，劉永霞. 外源GA3處理對(duì)黃皮白肉火龍果紅衣發(fā)芽及幼苗鮮重的影響[J]. 中國南方果樹，2016，45（5）：73-75.

[20] 葛 宇，丁哲利，程志號(hào)，等. 3種火龍果種子萌發(fā)及其幼苗形態(tài)的比較研究[J]. 種子，2017，36（7）：22-24.

[21] 黃春華，楊健榮，梁秋玲，等. ‘蜜寶火龍果的組織培養(yǎng)技術(shù)[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)工程，2013，37（3）：31-33.