等效面法分析3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶的聯(lián)合作用

葛會(huì)林 陶珊珊 智霞 袁宏球 蘇冰霞 馬晨

摘 要 為了更好地評(píng)估與預(yù)測三元混合物的毒性相互作用，以3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘殺威、滅多威、速滅威為研究對(duì)象，應(yīng)用均分等效面設(shè)計(jì)（EESD）法配制三元混合物，應(yīng)用直接均分射線設(shè)計(jì)法（EquRay）配制兩兩混合的二元混合物，測定混合物對(duì)乙酰膽堿酯酶（AChE）的抑制效應(yīng)，基于三角形的3次插值方法構(gòu)建三元混合物在20%、50%、80%效應(yīng)的等效面，以濃度加和（CA）與獨(dú)立作用（IA）為參考模型分析混合物的毒性相互作用。結(jié)果表明，Weibull函數(shù)能良好地?cái)M合3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其混合物對(duì)AChE的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)（R2>0.99，RMSE<0.03）?；诘刃娣治?，殘殺威、滅多威、速滅威的三元及二元混合物毒性符合CA模型，呈現(xiàn)加和作用，而IA輕微高估了混合物的毒性。共毒系數(shù)法也證實(shí)這3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥呈現(xiàn)加和作用?；貧w分析發(fā)現(xiàn)三元混合物毒性（pECx）與速滅威的濃度分?jǐn)?shù)具有良好的負(fù)相關(guān)關(guān)系。均分等效面設(shè)計(jì)法與等效面分析法可用于有效評(píng)估三元混合物的聯(lián)合毒性。

關(guān)鍵詞 均分等效面設(shè)計(jì)法；等效面；氨基甲酸酯類農(nóng)藥；乙酰膽堿酯酶；濃度加和；獨(dú)立作用；加和作用；共毒系數(shù)法

中圖分類號(hào) X171.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In order to better assess and predict the combined toxicity of ternary mixture， three carbamate pesticides including propoxur， methomyl and metolcarb were selected as mixture components. The equipartition equivalent-surface design （EESD） method was used to design ternary mixtures， and the direct equipartition ray design （EquRay） was used to design binary mixtures. The toxicities of these mixtures inhibiting acetylcholinesterase were determined using the microplate toxicity analysis method. The equivalent-surfaces at 20%， 50% and 80% effects were constructed based on the triangle-based cubic interpolation method. The concentration addition （CA） and independent action （IA） as the additive reference models were used to analyze the toxic interaction. The results showed that the Weibull function fit well the concentration-response data of the three pesticides and their mixtures with R2>0.99 and RMSE<0.03. Based on the equivalent-surface analysis， the toxicities of ternary and binary mixtures of propoxur， methomyl， and metolcarb conformed to the CA prediction， showing an additive effect， while the IA prediction slightly overestimated the mixture toxicity. The method of co-toxicity coefficient also confirmed this additive effect of propoxur， methomyl， and metolcarb. Meanwhile， it was found that there was a good negative correlation between the ternary mixture toxicity （pECx） and the concentration proportion of metolcarb. The equipartition equivalent-surface design method and equivalent-surface analysis method could be effectively used to analyze the joint toxicity of ternary mixture.

Key words equipartition equivalent-surface design method； equivalent-surface； carbamate pesticides； acetylcholinesterase； concentration addition； independent action； additive effect； co-toxicity coefficient

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.033

氨基甲酸酯類農(nóng)藥（carbamate pesticides，CBPs）是一種廣譜殺蟲、殺螨、除草劑，具有選擇性強(qiáng)、高效、對(duì)人畜和魚類低毒等特點(diǎn)[1]，多以混劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)林牧業(yè)[2]，但對(duì)生態(tài)環(huán)境尤其是水環(huán)境造成的污染與影響日益嚴(yán)重[3]。CBPs多與有機(jī)磷類和菊酯類藥劑混用，如滅多威和辛硫磷混用防治棉鈴蟲，異丙威和氯氰菊酯混用防治十字花科蔬菜蚜蟲[4]，少數(shù)有三元或多元混劑，同類CBPs藥劑之間混用的研究及應(yīng)用較少。

實(shí)際環(huán)境中因農(nóng)藥混用所殘留的低劑量混合污染物導(dǎo)致的累積毒性與相互作用（加和、協(xié)同及拮抗）已引起人們廣泛關(guān)注[5]，一般使用酶[6]、細(xì)胞[7]、細(xì)菌、藻類[8]、魚[9]、鼠等來表征污染物及其混合物的毒性。如孫金秀等[10]研究表明滅多威與辛硫磷、速滅威與甲胺磷以等毒性劑量混配對(duì)大鼠急性經(jīng)口毒性為加和作用，而滅多威與甲基對(duì)硫磷為拮抗作用，異丙威與馬拉硫磷為協(xié)同作用。張瑾等[11]應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)射線法研究了五元CBPs混合物對(duì)青?；【亩拘蕴攸c(diǎn)，觀察到組分不同濃度配比可導(dǎo)致加和或拮抗作用。

等效線圖是評(píng)價(jià)混合物組分間毒性相互作用的常用方法，已用于評(píng)價(jià)麥田2種除草劑混合物[12]和稻田2種殺蟲劑混合物[13]的聯(lián)合作用，確定兩種止痛藥的加和作用藥效[14]，表征抗菌藥物的抑菌動(dòng)力學(xué)[15]等。大多數(shù)情況中等效線圖用于分析二元混合物的毒性相互作用。參考等效線的空間幾何意義，對(duì)于三元混合物，可構(gòu)建等效面進(jìn)行分析，如劉雪等[16]以CA為參考模型，建立了3種除草劑及3種殺蟲劑在50%效應(yīng)水平下的三維等效面，分析得出三元除草劑混合物呈加和作用，三元?dú)⑾x劑混合物呈現(xiàn)加和作用與拮抗作用。顧中言等[17]用甲維鹽、毒死蜱、吡蚜酮3種藥劑對(duì)害蟲的LC50值作理論等效面，研究了田間試驗(yàn)中混劑對(duì)害蟲的毒力和互作效應(yīng)。然而，基于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法應(yīng)用等效面來系統(tǒng)分析三元CBPs聯(lián)合毒性作用規(guī)律的研究鮮有報(bào)道。

化學(xué)物聯(lián)合毒性的評(píng)估和預(yù)測通?；贑A和IA兩個(gè)加和參考模型。CA一般用于預(yù)測具有相似毒性作用機(jī)制的混合物。CA模型表明，只要毒性單位的總和保持不變，混合物中的每種化合物都可以被另一種化合物替代而不改變總毒性[18]。CA模型在笛卡爾坐標(biāo)空間可表示為圖形，對(duì)于二元混合物是直線形式的等效線，對(duì)于三元混合物則是平面三角形形式的等效面。而IA模型通常適用于相異毒性作用機(jī)制的化學(xué)物質(zhì)構(gòu)成的混合物。IA假定毒物首先與不同的分子靶點(diǎn)相互作用，經(jīng)過生物體內(nèi)不同的連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生一個(gè)共同的毒理學(xué)指標(biāo)；在此假設(shè)下，混合物中各組分的效應(yīng)在概率意義上被認(rèn)為是彼此相互獨(dú)立的[19]。

本研究選擇殘殺威、滅多威、速滅威作為代表性CBPs農(nóng)藥組分，采用直接均分射線法配制兩兩組合的二元混合物，采用均分等效面設(shè)計(jì)法配制三元混合物，基于微板毒性分析法測定混合物對(duì)乙酰膽堿酯酶（AChE）的抑制效應(yīng)，建立三者觀測的等效面，通過比較觀測與CA、IA預(yù)測的等效面來分析混合物的毒性相互作用，為CBPs在環(huán)境中復(fù)合污染的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和農(nóng)業(yè)上的合理施用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Synergy2型多功能微孔板測定儀（美國BioTek公司），AL204型四位電子天平（梅特勒-托利多公司），雷磁PHS-3E型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），96孔透明微板（Corning 9018）。

碘化硫代乙酰膽堿（ATCI）、二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）、電鰻AChE、殘殺威（propoxur，PPX）、滅多威（methomyl，MTM）與速滅威（metolcarb，MTC）相關(guān)的具體信息見表1。ATCI、DTNB、AChE、PPX、MTM與MTC分別溶解于pH 6.8的磷酸鹽緩沖液（含0.025 mol/L KH2PO4與0.025 mol/L Na2HPO4·12H2O）并避光保存于4 ℃冰箱中。為溶解DTNB，每克DTNB添加0.379 g的NaHCO3[20]。

1.2 方法

1.2.1 混合物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于殘殺威、滅多威與速滅威的儲(chǔ)備液濃度（c0）與EC50，采用均分等效面設(shè)計(jì)法（待發(fā)表），將構(gòu)成50%效應(yīng)等效面的3條等效線各自3等分，從等分點(diǎn)分別作對(duì)面2條等效線的平行線，從而將等效面均分為9個(gè)全等三角形，將這9個(gè)小三角形的重心坐標(biāo)對(duì)應(yīng)于3個(gè)組分的9個(gè)濃度配比，設(shè)計(jì)組分毒性單位比依次為1∶1∶7、4∶1∶4、2∶2∶5、1∶4∶4、7∶1∶1、5∶2∶2、4∶4∶1、2∶5∶2、1∶7∶1的9條混合物射線（G1～G9）。同時(shí)依據(jù)經(jīng)典方法設(shè)置EC50比混合物射線G0。對(duì)于二元混合物，利用直接均分射線法[21]按照毒性單位比1∶5、2∶4、3∶3、4∶2、5∶1兩兩混合設(shè)計(jì)B1～B15的二元混合物射線，其中B3、B8、B13為EC50比混合物射線。這些混合物射線中各組分的濃度分?jǐn)?shù)見表2。

1.2.2 乙酰膽堿酯酶微板毒性分析 采用基于AChE的微板毒性分析法（待發(fā)表），在96孔微板的前11列設(shè)置11個(gè)對(duì)數(shù)梯度濃度污染物，第12列設(shè)置空白對(duì)照，每孔依次加入50 μL 1 g/L的DTNB、50 μL 1 g/L的ATCI、50 μL 0.2 U/mL的AChE，于412 nm下測定0 min與15 min的OD值，全程使用空調(diào)控溫（29±1） ℃。

污染物對(duì)AChE的抑制效應(yīng)E按照公式（1）計(jì)算，得到的劑量-效應(yīng)曲線（DRC）使用公式（2）所示W(wǎng)eibull函數(shù)進(jìn)行最小二乘法擬合并求95%的觀測置信區(qū)間[22]，

計(jì)算得到效應(yīng)濃度如EC80、EC50、EC20等。

式中ΔODt為處理溶液15 min時(shí)吸光度變化值，ΔODc為對(duì)照溶液15 min時(shí)吸光度變化值，C為濃度，E為效應(yīng)，a為位置參數(shù)，b為斜率參數(shù)。

1.2.3 混合物毒性預(yù)測與評(píng)估 使用公式（3）所示CA模型與公式（4）所示IA模型構(gòu)建混合物的等效面，對(duì)混合物毒性進(jìn)行預(yù)測與評(píng)估。為了驗(yàn)證等效面分析法，同時(shí)采用簡單、實(shí)用的共毒系數(shù)法[23]評(píng)估混合物的毒性相互作用。將3個(gè)組分中毒性最大的滅多威（MTM）作為標(biāo)準(zhǔn)藥劑，各組分的毒力指數(shù)（toxicity index，TI）按公式（5）計(jì)算，混合物的理論毒力指數(shù)（theoretical toxicity index，TTI）按公式（6）計(jì)算，混合物的實(shí)際毒力指數(shù)（actual toxicity index，ATI）按公式（7）計(jì)算，根據(jù)公式（8）求得混合物的共毒系數(shù)（co-toxicity coefficient，CTC）。混合物CTC值小于80%為拮抗作用，大于120%為協(xié)同作用，80%～120%之間為加和作用。

式中n是混合物的組分?jǐn)?shù)，ci是產(chǎn)生效應(yīng)x%的混合物中組分i的濃度，ECx，i是組分i單獨(dú)引起x%效應(yīng)時(shí)的濃度，ECx，mix是產(chǎn)生x%效應(yīng)的混合物濃度，Pi是組分i在混合物中的濃度分?jǐn)?shù)，Emix為混合物的效應(yīng)，Ei為組分i產(chǎn)生的效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單個(gè)化合物劑量-效應(yīng)曲線分析

從圖1可看出，殘殺威、滅多威、速滅威對(duì)AChE抑制毒性的DRC呈良好的S型曲線，空白變異在測試中控制在了±10%以內(nèi)。DRC經(jīng)最小二乘法回歸的統(tǒng)計(jì)參數(shù)見表2，均方根誤差（RMSE）均小于0.03，決定系數(shù)（R2）均大于0.99，擬合統(tǒng)計(jì)性顯著。故單個(gè)物質(zhì)DRC可用Weibull函數(shù)有效表征，擬合得到的參數(shù)如DRC位置參數(shù)a、斜率參數(shù)b、EC80（80%效應(yīng)濃度）、EC50（50%效應(yīng)濃度）、EC20（20%效應(yīng)濃度）等列于表2。

殘殺威、滅多威、速滅威的a值分別為9.360、9.466、6.495，殘殺威與滅多威的a值相差不大，兩者的毒性差異也不大，但與速滅威的毒性差異較大。基于EC50，可得出對(duì)AChE抑制效應(yīng)的大小順序?yàn)椋簻缍嗤?殘殺威>速滅威，滅多威與速滅威EC50的差距接近兩個(gè)數(shù)量級(jí)，單個(gè)物質(zhì)各自的EC80與EC20的差距接近一個(gè)數(shù)量級(jí)。3個(gè)物質(zhì)的b值分別為1.834、1.753、1.760，表明三者DRC曲線的陡度接近，毒性隨濃度的增加變化趨勢也相近（圖1）。

2.2 基于劑量-效應(yīng)曲線的混合物毒性分析

圖2為三元混合物射線G0～G9與二元混合物射線B1～B15對(duì)AChE的DRC。結(jié)果表明，所有混合物射線的DRC都可用Weibull函數(shù)有效擬合，R2均大于0.99，RMSE均小于0.03。擬合得到混合物射線的效應(yīng)濃度EC80、EC50、EC20同列于表2。觀察后發(fā)現(xiàn)，二元或三元混合物射線的EC80、EC50、EC20都分別位于組分EC80、EC50、EC20的最大值與最小值之間。

綜合來看，對(duì)于三元及二元混合物射線，CA模型預(yù)測的DRC均位于觀測DRC的95%置信區(qū)間內(nèi)，混合物呈現(xiàn)加和作用，其中G0、G1、G4、G6、G7、G9、B2、B3、B5～B7、B9～B15混合物射線的觀測DRC良好符合CA預(yù)測的DRC。而IA模型輕微地高估了混合物毒性，同時(shí)IA預(yù)測的DRC均在CA預(yù)測DRC的上方。

2.3 基于等效面的混合物毒性相互作用分析

圖3為三元混合物在20%、50%、80%效應(yīng)的等效面的正視圖及側(cè)視圖，包括混合物觀測等效面、CA預(yù)測等效面和IA預(yù)測等效面三部分組成。圖3中的黑點(diǎn)為觀測等效點(diǎn)，共28個(gè)，分別是三角形邊線上的15個(gè)二元混合物觀測等效點(diǎn)，三角形內(nèi)10個(gè)三元混合物的觀測等效點(diǎn)，三角形3個(gè)頂點(diǎn)的單個(gè)組分的觀測等效點(diǎn)，所有的黑點(diǎn)都是等效應(yīng)的。黑點(diǎn)兩側(cè)的黑線為其95%置信區(qū)間，二元混合物觀測等效點(diǎn)的置信區(qū)間在正視圖中給出，三元混合物觀測等效點(diǎn)的置信區(qū)間在側(cè)視圖中給出。

這28個(gè)等效點(diǎn)通過基于三角形的三次方程插值得到混合物的觀測等效面，即圖中的網(wǎng)格曲面。而CA預(yù)測的等效面為圖3中的紅色三角形平面，IA預(yù)測的等效面為向內(nèi)凹的藍(lán)色三角形曲面。三角形等效面的3條邊為相應(yīng)二元混合物的觀測或預(yù)測的等效線。基于模型（CA與IA）預(yù)測的三元混合物等效面與二元混合物等效線的數(shù)學(xué)方程見表3。

圖3的20%、50%、80%效應(yīng)的等效面正視圖中，二元混合物的15個(gè)觀測等效點(diǎn)基本都符合CA模型；IA預(yù)測等效線相對(duì)CA內(nèi)凹，但總體上也位于觀測點(diǎn)的置信區(qū)間內(nèi)。在側(cè)視圖中，網(wǎng)格顯示的觀測等效面均位于CA與IA構(gòu)成的加和性空間中，其中80%效應(yīng)的觀測等效面很好地符合CA模型?；趫D3的等效面分析可知，殘殺威、滅多威、速滅威的三元及二元混合物在20%、50%、80%效應(yīng)水平均為加和作用。上述結(jié)果與基于DRC的分析一致。

2.4 共毒系數(shù)法驗(yàn)證

從表4可知，除G3在20%效應(yīng)水平的CTC為120.48%外，G0～G9混合物射線在20%、50%、80%效應(yīng)水平的CTC值的范圍為93.01%～113.82%，呈現(xiàn)良好的加和作用。這與基于劑量-效應(yīng)曲線及基于等效面的混合物毒性相互作用分析結(jié)果相同。共毒系數(shù)法與CA等效面法判斷結(jié)果一致，進(jìn)一步證明等效面法可用于三元混合物毒性相互作用分析與判斷的可行性。

2.5 混合物毒性與單個(gè)物質(zhì)濃度分?jǐn)?shù)的關(guān)系

將單個(gè)組分濃度分?jǐn)?shù)與三元混合物毒性（pEC20、pEC50、pEC80）做散點(diǎn)圖，觀察到混合物毒性與殘殺威、滅多威的濃度分?jǐn)?shù)沒有明顯的相關(guān)關(guān)系，但兩者散點(diǎn)圖的分布模式較為相似；混合物毒性與最小毒性組分速滅威的濃度分?jǐn)?shù)具有較好的負(fù)相關(guān)（R2均大于0.91），擬合曲線見圖4。這表明混合物毒性可能與其中組分的濃度分?jǐn)?shù)具有相關(guān)關(guān)系。

3 討論

農(nóng)藥混配后所產(chǎn)生的聯(lián)合作用與藥劑種類[10]和混配比例[24]密切相關(guān)。同種藥劑由于作用靶位點(diǎn)相同，理論上呈現(xiàn)加和作用。其中有機(jī)磷農(nóng)藥作為較早進(jìn)行聯(lián)合暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的化合物[25]，研究尤為深入。二元有機(jī)磷混合物大多數(shù)呈現(xiàn)加和作用[26]，也有部分呈現(xiàn)協(xié)同作用如毒死蜱和馬拉硫磷[27]，部分呈現(xiàn)拮抗作用如辛硫磷與甲基對(duì)硫磷[10]。少數(shù)報(bào)道評(píng)估了氨基甲酸酯類農(nóng)藥的聯(lián)合作用。如涕滅威、殘殺威、呋喃丹、滅多威、抗蚜威對(duì)青海弧菌的聯(lián)合毒性研究中，觀察到拮抗作用多于加和作用，混合物毒性與組分毒性處于中間的滅多威的濃度分?jǐn)?shù)呈良好的負(fù)相關(guān)性[11]。而本研究中混合物毒性與最小毒性組分速滅威的濃度分?jǐn)?shù)具有較好的負(fù)相關(guān)。另一方面，Ge等[28]在研究苯胺類、硝基苯類、苯酚類和鄰苯二甲酸酯混合物對(duì)發(fā)光菌Q67的聯(lián)合作用時(shí)，觀察到混合物毒性與最大毒性組分鄰苯二甲酸二乙酯的濃度分?jǐn)?shù)具有良好的正相關(guān)關(guān)系。

殘殺威、滅多威、速滅威對(duì)AChE的聯(lián)合作用符合CA加和作用。一般認(rèn)為混合物組分具有相似毒性作用機(jī)制時(shí)可采用CA預(yù)測，若相異則可采用IA預(yù)測[19]。事實(shí)上，CA與IA僅是2個(gè)數(shù)學(xué)方程，與化合物毒性作用機(jī)制聯(lián)系起來還需要從機(jī)理方面進(jìn)行嚴(yán)格的論證；但在實(shí)際情況中，CA用于相似作用物的機(jī)會(huì)更多一些。劉樹深等[29]認(rèn)為CA仍只是一個(gè)工作模型，沒有堅(jiān)實(shí)的理論支持，也不宜與作用機(jī)理相關(guān)聯(lián)。

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