杉木天冬酰胺合成酶基因的克隆與表達(dá)分析

饒麗莎　官清娜　林思祖　葉義全　許珊珊

摘 要 為了解天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase， AS）基因在杉木生長(zhǎng)發(fā)育及逆境中的作用機(jī)制，以杉木種子及其萌發(fā)的幼苗為材料，利用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得杉木ASN基因的cDNA序列（ClASN1）和基因組序列，并對(duì)該基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和逆境脅迫下的表達(dá)模式和Asn含量變化進(jìn)行分析。結(jié)果表明：ClASN1基因cDNA全長(zhǎng)1 609 bp，編碼443個(gè)氨基酸；生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該基因?yàn)楹缒そY(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定親水蛋白，無(wú)信號(hào)肽，定位于過(guò)氧化物酶體，具有多樣的磷酸化位點(diǎn)；進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，該基因與北美云杉和樟子松親緣關(guān)系最近；ClASN1基因組序列全長(zhǎng)3 210 bp，含10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子；qPCR結(jié)果表明，該基因從浸種24 h到幼苗期表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，且在干旱脅迫、鋁脅迫和光暗處理下均可誘導(dǎo)表達(dá)；除鋁脅迫24 h和持續(xù)光照24 h外，ClASN1表達(dá)模式與Asn含量的變化趨勢(shì)相同，此結(jié)果表明ClASN1基因通過(guò)催化Asn的合成參與杉木幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫響應(yīng)。

關(guān)鍵詞 杉木；ASN基因；克??；表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào) S791.27 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In order to investigate the underlying mechanism of ASN gene of Cunninghamia lanceolata in the growth stages and under abiotic stresses， RT-PCR combined with RACE was employed to clone the complete cDNA sequence and DNA sequence from Cunninghamia lanceolata seedling， and the expression of ClASN1 gene and the Asn content under various growth stages and abiotic stresses were analyzed. The results showed that the complete cDNA sequence of ClASN1 was 1 609 bp， encoding 443 amino acids. The bioinformatics software predicted that ClASN1 protein was unstable and hydrophilic with transmembrane structure without signal peptide， located in peroxidase and with various phosphorylation sites. Anglicizing phylogenetic tree of ASN genes in different plants indicated that ClASN1 had the closest relative with Picea sitchensis and Pinus sylvestris. The full length of genomic ClASN1 was 3 210 bp， which contained 10 exons and 9 introns. qPCR results showed that the expression of ClASN1 increased with the time elapsed from seed germination to seedling stage， and was also induced under drought stress， aluminum stress and light dark stress， moreover， the general expression tendencies of ClASN1gene accorded with the content of Asn under various stages from seed germination to seedling growth and different stresses expect for aluminum stress 24 h and light stress 24 h. In conclusion， the above results suggested that ClASN1 may play a role in the various stages from seed germination to seedling growth and stress responses.

Key words Cunninghamia lanceolata； ASN gene； cloning； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.016

氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量元素之一，同時(shí)也是植物體內(nèi)許多重要生物大分子的組成成分，如核酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等，因此，它對(duì)植物的產(chǎn)量和品質(zhì)的形成具有重要的調(diào)控作用[1]。在當(dāng)前高投入的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式下，通過(guò)增施氮肥是獲得植物高產(chǎn)的主要措施之一。但是，氮肥的過(guò)量施用不僅會(huì)顯著增加生產(chǎn)成本，導(dǎo)致大量無(wú)機(jī)氮在土壤中積累，而且還容易造成資源浪費(fèi)甚至引起一系列環(huán)境問(wèn)題[2]。因此，在保證植物產(chǎn)量的前提下，研究如何通過(guò)提高植物對(duì)氮的同化/利用效率達(dá)到“減施增效”的目的，對(duì)于改善環(huán)境污染和實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

植物從土壤環(huán)境中吸收不同形態(tài)的氮素如銨態(tài)氮（NH4+）、硝態(tài)氮（NO3-）及氨基態(tài)氮后，NO3-首先經(jīng)相關(guān)還原酶還原形成NH4+，隨后NH4+經(jīng)過(guò)谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶的作用催化形成谷氨酰胺和谷氨酸，它們是植物體內(nèi)含氮化合物的前體，用于合成各種氨基酸[3]。植物天冬酰胺的合成主要通過(guò)天冬酰胺合成酶轉(zhuǎn)移谷氨酰胺的氨基到天冬氨酸形成的。由于天冬氨酸具有高氮碳比（N：C=4：2）和強(qiáng)穩(wěn)定性等特點(diǎn)，是植物韌皮部?jī)?nèi)有機(jī)氮存儲(chǔ)和運(yùn)輸?shù)睦硐氘a(chǎn)物之一，在調(diào)控植物體內(nèi)氮同化與循環(huán)中扮演十分關(guān)鍵的角色[4]。因此，作為調(diào)控該產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶——天冬酰胺合成酶被認(rèn)為在植物氮代謝和植物體內(nèi)氮的源庫(kù)關(guān)系調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[5]。已有研究結(jié)果表明，在5個(gè)具有不同蛋白質(zhì)含量的大豆種子中，幼苗葉片中天冬酰胺合成酶基因AS1的表達(dá)量與其種子中與天冬酰胺合成酶活性及種子中的蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)[6]。周麗慧等[7]研究也發(fā)現(xiàn)不同秈亞種或粳亞種的水稻品種內(nèi)，天冬酰胺合成酶基因OsAS的表達(dá)量與籽粒蛋白質(zhì)含量存在一定的關(guān)聯(lián)。Lam等[8]通過(guò)分子生物學(xué)手段直接證實(shí)了天冬酰胺合成酶在植物體內(nèi)氮代謝和氮的源庫(kù)關(guān)系調(diào)節(jié)中的重要作用，通過(guò)表達(dá)擬南芥天冬酰胺合成酶基因ASN1，顯著增加了韌皮部中天冬酰胺的含量，促進(jìn)了天冬酰胺從原組織（葉和莖）到庫(kù)組織（花和果實(shí)）的運(yùn)輸，進(jìn)而改善了擬南芥種子中氮營(yíng)養(yǎng)的狀況。此外，有的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)天冬酰胺介導(dǎo)的氮代謝的調(diào)節(jié)在調(diào)控植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要的作用[9-10]。因此，開(kāi)展氮素同化與利用相關(guān)基因的克隆和功能研究，有助于從更深層次闡明植物氮素同化利用的分子機(jī)制，為進(jìn)一步利用分子生物學(xué)手段提高植物氮素利用效率提供理論依據(jù)。

天冬酰胺合成酶是廣泛存在于植物體內(nèi)的氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員，主要由一類(lèi)由小基因家族所編碼[11]。目前已從許多植物中成功克隆到天冬酰胺合成酶基因（Asparagine Synthetase，ASN），如在擬南芥[12]、煙草[13]、玉米[14]、桑樹(shù)[15]、大豆[16-17]、小黑麥[18]、番茄[19]和水稻[20]等，但這些研究主要集中在一些草本植物中，而對(duì)于木本植物的研究較少[21]。杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國(guó)南方重要的速生用材樹(shù)種，因其具有速生和材質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，在我國(guó)南方廣泛種植[22]。由于我國(guó)南方林地土壤屬于典型的富鐵鋁化酸性土壤，酸性土壤本身就不利于土壤中氮素的固持。此外，我國(guó)南方屬于典型的亞熱帶季風(fēng)氣候，夏季高溫多雨，還容易引起土壤中可利用性氮素淋溶損失[23]。因此，長(zhǎng)期以來(lái)氮素缺乏是限制杉木人工林林分生產(chǎn)力提高的一個(gè)重要障礙因子。因此，選育氮高效杉木新品種，提高杉木對(duì)氮的吸收與利用效率，是未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)森林培育學(xué)家開(kāi)展杉木速生豐產(chǎn)林培育的一個(gè)重要研究方向，而探明杉木對(duì)氮素吸收利用的分子機(jī)制是開(kāi)展杉木氮高效品種選育和遺傳改良的基礎(chǔ)。因此，本研究以杉木優(yōu)良家系實(shí)生幼苗為研究對(duì)象，通過(guò)分離和鑒定杉木天冬酰胺合成酶基因ASN1，并分析其在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段及逆境脅迫下的差異表達(dá)情況及其與天冬酰胺（asparagine，Asn）含量變化之間的關(guān)系，以期為后續(xù)進(jìn)一步揭示杉木氮素營(yíng)養(yǎng)高效利用的分子機(jī)制和選育氮高效利用新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年3代杉木良種及其萌發(fā)的的實(shí)生幼苗，由福建省沙縣官莊國(guó)有林場(chǎng)提供。植物基因組DNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司，SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒購(gòu)自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 分別在浸種24 h、種子出芽、胚根伸長(zhǎng)、幼苗4個(gè)階段進(jìn)行取樣，用于qPCR分析。將萌發(fā)2周的杉木幼苗用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，然后分別進(jìn)行干旱脅迫、鋁脅迫和光暗脅迫，并取樣進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。干旱脅迫是用含有5% PEG-6000的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行0、6、12、24 h的脅迫處理，以不含5% PEG-6000的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的幼苗作為對(duì)照。鋁脅迫是用含1 mmol/L AlCl3·6H2O的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行0、3、6、12、24、48 h鋁脅迫處理，結(jié)束時(shí)取樣分析，以不含1 mmol/L AlCl3·6H2O的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的幼苗作為對(duì)照。光暗處理是將在正常光照周期（16 h光照/8 h黑暗）生長(zhǎng)的杉木幼苗分別進(jìn)行0、12、24、48 h的持續(xù)光照處理和持續(xù)黑暗處理，同時(shí)以光照周期16 h光照/8 h黑暗為對(duì)照處理。

1.2.2 總RNA和DNA的提取及cDNA合成 采用改良的CTAB法[24]提取杉木總RNA，采用植物基因組DNA提取試劑盒提杉木DNA，用紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電檢測(cè)總RNA和DNA的濃度和純度。根據(jù)TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行保守區(qū)cDNA合成，采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行3'RACE和5'RACE的cDNA合成。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中已登錄的與杉木親緣關(guān)系較近的物種ASN序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物用于保守區(qū)擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增測(cè)序得到的保守區(qū)序列分別設(shè)計(jì)3'RACE和5'RACE特異性引物，將獲得的保守區(qū)、3'RACE和5'RACE序列進(jìn)行拼接，并在其起始密碼子和終止密碼子附近設(shè)計(jì)1對(duì)引物，用于ORF框驗(yàn)證及基因組序列擴(kuò)增。本試驗(yàn)所用引物名稱及序列見(jiàn)表1。

保守區(qū)和5'RACE序列的PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，43～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s～2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

3'RACE序列的PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性30 s，72 ℃退火2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，5個(gè)循環(huán)； 94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s ，72 ℃延伸2 min，20個(gè)循環(huán)。

1.2.4 目的片段回收、克隆和測(cè)序 采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收，連接至pGEM-T-Easy載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆子委托北京六合華大基因生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN和ORF Finder軟件對(duì)克隆獲得的天冬酰胺合成酶基因核酸序列進(jìn)行拼接和開(kāi)放性閱讀框預(yù)測(cè)。使用在線軟件對(duì)天冬酰胺合成酶基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)（ExPASy Protparam）、亞細(xì)胞定位（Psort）、信號(hào)肽（SignaIP 4.1 Server）、跨膜結(jié)構(gòu)（ExPASy）、磷酸化位點(diǎn)（NetPhos 2.0 Sever）、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)（EMBnet Coils）、二級(jí)結(jié)構(gòu)（GOR IV）、三級(jí)結(jié)構(gòu)（SWISSMODEL）進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。利用GSDS軟件預(yù)測(cè)內(nèi)含子和外顯子的位置和數(shù)量。利用MEGA5.02（臨位相連法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.6 qPCR擴(kuò)增與分析 本研究采用SYBR Premix Ex Taq試劑和羅氏LightCyclerRNano儀器，以杉木β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，β-actin-F和β-actin-R為qPCR上下游引物，采用3步法，分析杉木ANS基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、干旱脅迫、鋁脅迫和光暗脅迫下的表達(dá)情況。相對(duì)表達(dá)量的算法參照[25-26]的方法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.7 杉木Asn含量分析 采用酶聯(lián)免疫分析法對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、干旱脅迫、鋁脅迫和光暗處理下杉木Asn含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 8.5對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及繪圖，并用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杉木ASN基因的cDNA全長(zhǎng)序列擴(kuò)增

以杉木cDNA為模板，用引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序得到323 bp的保守片段（圖1-a）。以引物GSP1和GSP2分別進(jìn)行RACE試驗(yàn)，測(cè)序分別獲得了652 bp的3'序列和893 bp的5'序列（圖1-b、c）。利用DNAMAN軟件將所獲得的3段序列進(jìn)行拼接，得到1 609 bp的杉木ASN基因cDNA全長(zhǎng)。進(jìn)一步利用引物F2和R2進(jìn)行ORF驗(yàn)證，測(cè)序得到1條與拼接結(jié)果相同的1 332 bp的ORF序列（圖1-d）。將該轉(zhuǎn)錄本在NCBI上進(jìn)行核酸序列和氨基酸序列比對(duì)，顯示該轉(zhuǎn)錄本與北美云杉、樟子松等已登錄的多種植物ASN基因高度同源，證明已獲得1 609 bp的杉木ASN基因cDNA全長(zhǎng)，其中5'UTR為127 bp，3'UTR為150 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 332 bp，編碼443個(gè)氨基酸，將這個(gè)轉(zhuǎn)錄本命名為ClASN1。

2.2 杉木ClASN1基因組序列擴(kuò)增及內(nèi)含子分析

以杉木DNA為模板，用ORF引物F2和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序得到ClASN1基因組的全長(zhǎng)3 210 bp（圖1-e），將該序列與ORF的cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，除了內(nèi)含子，其他序列完全一致。因此，所得序列為ClASN1基因的DNA序列。GSDS在線分析結(jié)果表明，該基因由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成，所有內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)符合GT-AG規(guī)則，所得序列結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。外顯子長(zhǎng)度分別為73、95、162、81、222、137、81、87、108、288 bp，平均長(zhǎng)度為133 bp；內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為208、100、102、114、347、127、129、544、108 bp，平均長(zhǎng)度為198 bp，其中最長(zhǎng)為544 bp，占該基因組長(zhǎng)度的17%。

2.3 杉木ClASN1基因的生物信息學(xué)分析

利用在線生物軟件對(duì)ClASN1基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ClASN1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為49.4 ku， pI等電點(diǎn)為6.68；該蛋白由20種氨基酸組成，以亮氨酸（Leu）和丙氨酸（Ala）含量最豐富，比例均為9.5%，帶49個(gè)正電荷（Lys+Arg）和52個(gè)負(fù)電荷（Glu+Asp），總平均親水性和不穩(wěn)定系數(shù)分別為-0.294和41.57，為親水的不穩(wěn)定蛋白。

通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，ClASN1蛋白定位于過(guò)氧化物酶體中，不含信號(hào)肽，為非分泌蛋白，且不具卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，在第66～86個(gè)殘基之間具有1個(gè)N末端朝外由外向內(nèi)的跨膜結(jié)構(gòu)，但該蛋白的確切信息則需要進(jìn)一步通過(guò)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果表明，該蛋白共有26個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為絲氨酸（Ser）13個(gè)、蘇氨酸（Thr）9個(gè)和酪氨酸（Tyr）4個(gè)。GOR IV二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋所占比例較大，β-折疊所占比例最小。SWISSMODEL三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)論與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)論相符（圖3）。

根據(jù)MEGA5.02臨位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4，ClASN1基因與北美云杉和樟子松親緣關(guān)系最近，與擬南芥、紫云英的關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 杉木ClASN1基因的定量表達(dá)分析

2.4.1 杉木幼苗不同生長(zhǎng)發(fā)育階段ClASN1基因的表達(dá)分析 以β-actin為內(nèi)參基因，分析ClASN1基因在杉木幼苗不同生長(zhǎng)發(fā)育階段（浸種24 h、種子出芽、胚根伸長(zhǎng)、幼苗）的表達(dá)模式，結(jié)果見(jiàn)圖5，ClASN1基因在4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段均有表達(dá)，且表達(dá)量隨生長(zhǎng)時(shí)間的增加而顯著上升，其中在幼苗期表達(dá)量迅速增加，達(dá)到最高值，變化幅度大，說(shuō)明ClASN1基因在該階段表現(xiàn)活躍 。

2.4.2 干旱脅迫下杉木ClASN1基因的表達(dá)分析 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析干旱脅迫下ClASN1基因的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖6，在干旱脅迫下，ClASN1基因整體表現(xiàn)出前期變化不明顯后期表達(dá)量顯著增加的變化趨勢(shì)。具體來(lái)說(shuō)，在干旱脅迫6 h時(shí)，ClASN1基因的表達(dá)量與對(duì)照組相比并無(wú)明顯差異；當(dāng)干旱脅迫12 h時(shí)，ClASN1基因的表達(dá)量快速且顯著增加，為對(duì)照組的3.8倍；繼續(xù)脅迫到24 h時(shí)，ClASN1基因的表達(dá)量繼續(xù)增加并達(dá)到最大值，此時(shí)ClASN1基因的表達(dá)量為對(duì)照的4.7倍。由此可見(jiàn)，杉木ClASN1基因可受干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。

2.4.3 鋁脅迫下杉木ClASN1基因表達(dá)分析 由圖7可知，鋁脅迫下，杉木ClASN1基因的表達(dá)量均高于對(duì)照組，并表現(xiàn)出早期受誘導(dǎo)強(qiáng)烈表達(dá)，后期表達(dá)量有所下降并呈現(xiàn)波動(dòng)變化，但仍高于對(duì)照的變化趨勢(shì)。具體來(lái)講，在鋁脅迫前6 h，ClASN1基因的表達(dá)量顯著上升，并在6 h時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)ClASN1基因的表達(dá)量為對(duì)照的26.8倍；之后當(dāng)鋁脅迫至12 h時(shí)，其表達(dá)量急劇下降；鋁脅迫24 h時(shí)，其表達(dá)量又略有下降；而在鋁脅迫48 h時(shí)，ClASN1基因的表達(dá)量又有所上升；但在脅迫后期 （12～48 h） ，

ClASN1基因的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照。由此可見(jiàn)，杉木ClASN1基因同樣可受鋁脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，暗示其在杉木適應(yīng)鋁脅迫環(huán)境過(guò)程中扮演著重要角色。

2.4.4 光暗處理下杉木ClASN1基因表達(dá)分析 為進(jìn)一步明確杉木ClASN1基因是否同樣能對(duì)光照和黑暗產(chǎn)生響應(yīng)，本研究進(jìn)一步對(duì)持續(xù)光照和黑暗下杉木ClASN1基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖8，持續(xù)光照12 h和24 h均可誘導(dǎo)ClASN1基因的表達(dá)量增加，且在12 h時(shí)表達(dá)量急劇上升，達(dá)到最高值，之后又迅速下降，當(dāng)持續(xù)光照48 h時(shí)，ClASN1表達(dá)量甚至比對(duì)照組低。而持續(xù)黑暗處理下，ClASN1基因的表達(dá)量雖有所變化，但整體變化幅度小，當(dāng)持續(xù)黑暗12 h時(shí)達(dá)到最高值，在暗處理后期（24～48 h）ClASN1基因的表達(dá)量逐漸降低，但在整個(gè)過(guò)程其表達(dá)量均顯著高于對(duì)照處理，說(shuō)明ClASN1基因在該黑暗條件下表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，均受黑暗顯著誘導(dǎo)。比較持續(xù)光照12 h和持續(xù)黑暗12 h時(shí)的表達(dá)量，可發(fā)現(xiàn)持續(xù)光照12 h的表達(dá)量顯著高于持續(xù)黑暗12 h時(shí)的表達(dá)量，表明ClASN1基因?qū)庹崭鼮槊舾小?/p>

2.5 杉木天冬酰胺Asn含量分析

采用酶聯(lián)免疫分析法對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、干旱脅迫、鋁脅迫和光暗處理下杉木Asn含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如下：杉木種子浸種24 h、種子出芽、胚根伸長(zhǎng)、幼苗4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段的Asn含量呈緩慢上升的趨勢(shì)（圖9），說(shuō)明在杉木幼苗的生長(zhǎng)階段，隨著幼苗的發(fā)育，植株代謝增強(qiáng)，需要大量的氮源，因而對(duì)天冬酰胺的需求也逐漸增加。干旱脅迫下，Asn含量整體呈升-降的變化趨勢(shì)，脅迫期間Asn含量均高于對(duì)照組，且當(dāng)脅迫12 h時(shí)達(dá)到最高值（圖10）。鋁脅迫下，Asn含量均高于對(duì)照組，整體呈升-降-升-降的變化趨勢(shì)，其中6 h時(shí)Asn含量上升至最高值，12 h時(shí)有所下降，24 h時(shí)Asn含量又再度上升，隨后48 h又下降（圖11）。持續(xù)光照和持續(xù)黑暗下，Asn含量均明顯高于對(duì)照組，持續(xù)光照或持續(xù)黑暗前24 h時(shí)，二者Asn含量基本一致，且12 h和24 h的Asn含量基本保持不變，穩(wěn)定維持在較高水平；48 h時(shí)Asn含量有所下降，但持續(xù)光照下的下降幅度較大（圖12）。

3 討論

氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量元素之一，在改善作物品質(zhì)提高作物產(chǎn)量中起著十分關(guān)鍵的作用。然而，氮素缺乏一直是我國(guó)南方富鐵鋁化酸性土壤上森林生態(tài)系統(tǒng)所面臨的重要問(wèn)題，它已成為制約我國(guó)南方杉木人工林林分生產(chǎn)力提高的主要障礙因子之一[27]。因此，選育氮高效杉木品種，提高杉木對(duì)氮的吸收利用效率已成為當(dāng)前解決林地氮缺乏的有效途徑之一。利用分子生物學(xué)技術(shù)開(kāi)展氮素同化與利用相關(guān)基因的克隆和功能研究則有助于闡明杉木氮素同化利用的分子機(jī)制，可為進(jìn)一步利用基因工程手段培育氮高效利用杉木品種提供理論依據(jù)。

本研究從杉木實(shí)生苗中克隆得到一個(gè)杉木天冬酰胺合成酶基因ClASN1，進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明該基因與北美云杉和樟子松親緣關(guān)系最近。天冬酰胺合成酶作為植物體內(nèi)氮代謝關(guān)鍵酶廣泛參與植物體內(nèi)各種生理過(guò)程，在調(diào)控植物體內(nèi)氮的源庫(kù)關(guān)系、種子萌發(fā)、抗逆及抗病中都扮演著重要角色[4， 28-29]。通常情況下，在種子萌發(fā)過(guò)程中，首先會(huì)將存儲(chǔ)在胚乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)活化供種子生長(zhǎng)需要。早期研究表明，火炬松種子萌發(fā)12 d后，幼苗中的天冬酰胺含量占氨基酸總含量的比例由50%上升到70%[30]。Rozan等[31]也發(fā)現(xiàn)在扁豆類(lèi)植物中天冬酰胺是其體內(nèi)最重要的氨基酸，該類(lèi)植物體內(nèi)的天冬酰胺含量范圍在18.96～62.24 mg/g之間，在扁豆種子萌發(fā)4 d后，其幼苗體內(nèi)天冬酰胺占氨基酸總量的比例由0%上升到40%～50%。由此可見(jiàn)，種子萌發(fā)和植物形態(tài)建成過(guò)程中天冬酰胺是植物體內(nèi)氮的主要運(yùn)輸形態(tài)之一，在調(diào)控種子萌發(fā)和植物形態(tài)建成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。此外，Wan等[6]研究表明大豆葉片的天冬酰胺合成酶基因AS1的表達(dá)量與天冬酰胺酶活及大豆種子中蛋白質(zhì)含量呈顯著相關(guān)。類(lèi)似的結(jié)果在水稻中也有觀察到[7]。Lam 等[8]通過(guò)分子生物學(xué)手段為天冬酰胺合成酶基因在調(diào)控植物體內(nèi)氮的源庫(kù)關(guān)系提供了遺傳學(xué)證據(jù)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)天冬酰胺合成酶基因ASN1，顯著增強(qiáng)了從源（葉）到庫(kù)（果莢）天冬酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加了種子天冬酰胺及蛋白質(zhì)的含量。上述結(jié)果表明，無(wú)論在種子萌發(fā)過(guò)程中的氮的活化還是在種子發(fā)育過(guò)程中氮的存儲(chǔ)，天冬酰胺合成酶均在這些過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。

本研究發(fā)現(xiàn)在杉木種子萌發(fā)成幼苗的不同階段中，植物體內(nèi)ClASN1基因表達(dá)量不斷增加，與該結(jié)果對(duì)應(yīng)的是其體內(nèi)天冬酰胺的含量也在不斷上升，二者表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，這與前人的結(jié)果一致。該結(jié)果暗示在杉木從種子萌發(fā)到幼苗形態(tài)建成的不同階段中，ClASN1基因介導(dǎo)的天冬酰胺的合成可能在該過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。除了種子萌發(fā)可誘導(dǎo)植物ASN基因表達(dá)，增加Asn含量外，研究表明ASN基因表達(dá)還受多種因素誘導(dǎo)，如光照、碳水化合物、鹽脅迫和重金屬脅迫等均可顯著誘導(dǎo)該基因的表達(dá)[4]。ASN基因的這種復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控模式暗示該基因可能在植物各種生理活動(dòng)過(guò)程中扮演著不同角色。干旱脅迫和重金屬脅迫誘導(dǎo)的ASN基因表達(dá)，在先前的研究中也有報(bào)道[32]。本研究也發(fā)現(xiàn)干旱脅迫能誘導(dǎo)杉木ClASN1基因的表達(dá)，與基因表達(dá)一致的是杉木體內(nèi)Asn含量也顯著增加，但到目前為止，干旱脅迫下誘導(dǎo)ASN基因表達(dá)的具體作用尚不完全清楚。一種可能的解釋就是在這些逆境脅迫條件下植物的光合能力顯著受抑，導(dǎo)致運(yùn)輸?shù)綆?kù)組織的碳水化合物減少，引起用于代謝的碳源不足，為維持體內(nèi)碳氮平衡，植物氮同化能力也會(huì)相應(yīng)下降，而蛋白質(zhì)分解代謝就會(huì)增強(qiáng)，為植物呼吸和其他代謝等活動(dòng)提供碳骨架[33]。與干旱脅迫結(jié)果類(lèi)似，本研究中同樣發(fā)現(xiàn)鋁脅迫能顯著誘導(dǎo)杉木ClASN1基因的表達(dá)，與基因表達(dá)趨勢(shì)基本一致的是杉木體內(nèi)Asn含量也顯著增加，且它們含量均顯著高于各自對(duì)照。

值得注意的是，本研究還發(fā)現(xiàn)在鋁脅迫下杉木體內(nèi)Asn含量出現(xiàn)一定的波動(dòng)現(xiàn)象（如第12、48小時(shí)杉木體內(nèi)Asn含量出現(xiàn)一定程度的下降），這種波動(dòng)現(xiàn)象表明在逆境條件下杉木體內(nèi)Asn含量處于動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，而這種Asn含量實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程尤其對(duì)于逆境脅迫下植物的生長(zhǎng)發(fā)育尤為關(guān)鍵，同時(shí)也暗示植物能通過(guò)不斷整合自身發(fā)育和環(huán)境信號(hào)對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)控，進(jìn)而實(shí)時(shí)調(diào)控相關(guān)酶活性和最終產(chǎn)物的含量，使植物更好地適應(yīng)逆境脅迫。因此，這種Asn含量的波動(dòng)現(xiàn)象從側(cè)面證實(shí)了Asn代謝可能在杉木適應(yīng)鋁脅迫環(huán)境中扮演重要角色，而這有待后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。此外，研究表明光照對(duì)ASN基因表達(dá)的調(diào)控比較復(fù)雜，一般而言，光能抑制ASN基因表達(dá)，而黑暗可誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。但事實(shí)上，一些植物對(duì)光不敏感甚至光照能誘導(dǎo)ASN基因的表達(dá)[34-36]。本研究也發(fā)現(xiàn)光對(duì)杉木ClASN1基因表達(dá)的調(diào)控比較復(fù)雜，在光照早期表現(xiàn)出強(qiáng)烈的誘導(dǎo)，而在后期其表達(dá)量顯著低于對(duì)照。與其它植物類(lèi)似，黑暗均誘導(dǎo)ClASN1基因的表達(dá)。前人與本研究結(jié)果共同表明，光對(duì)ASN基因復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控暗示該基因在響應(yīng)光照的不同階段扮演著不同的功能，至于杉木ClASN1基因在該過(guò)程中具體起著什么樣的作用有待后續(xù)進(jìn)一步的研究。

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