雞胸軟骨膠原的提取及其結(jié)構(gòu)表征

張艷艷 劉海英

摘要 [目的]提取雞胸軟骨中的膠原，并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。[方法]以雞胸軟骨為原料，采用酶法提取其中的膠原，并進(jìn)行紫外光譜檢測(cè)、傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)、SDS-PAGE、氨基酸分析、圓二色譜檢測(cè)及肽指紋圖譜檢測(cè)。[結(jié)果]膠原的提取率是0.11%（以濕重計(jì)），紫外最大吸收波長(zhǎng)為217 nm；SDS-PAGE顯示，膠原含有一條較粗的α帶和一條較細(xì)的β帶；氨基酸分析顯示，羥脯氨酸為99殘基/1 000氨基酸殘基。[結(jié)論]該方法提取得到的膠原是典型的Ⅱ型膠原，且很好地保持了其天然結(jié)構(gòu)，具有較高的純度。

關(guān)鍵詞 膠原；雞胸軟骨；Ⅱ 型膠原；提??；結(jié)構(gòu)表征

中圖分類號(hào) S879；TS251.92文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）15-0155-03

Abstract [Objective]The research aimed to extract collagen from chicken sternal cartilage and detected it.[Methods]Using chicken sternal cartilage as raw material，the collagen was extracted by enzymatic method and detected by ultraviolet spectroscopy，F(xiàn)ourier transform infrared spectroscopy，SDS-PAGE，amino acid analysis，circular dichroism detection and peptide fingerprint detection.[Result]The extraction rate of collagen is 0.11%，based on the wet weight of chicken sternal cartilage.Ultraviolet spectral analysis showed that the characteristic absorption wavelength of collagen was 217 nm.Analysis results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide-gel electrophoresis（SDS-PAGE） showed that there was a heavy α-chain and a light β-chain.Amino acid components showed that hydroxyproline was 99 imino acid residues/1 000 residues.[Conclusion]The collagen extracted by this method is a typical type Ⅱ collagen，and its natural structure is well maintained with high purity and the product has a high purity.

Key words Collagen；Chicken sternal cartilage；Type Ⅱ collagen；Extraction；Structural characterization

膠原是一類具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物組織中，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最豐富的蛋白質(zhì)，約占整個(gè)細(xì)胞總蛋白的1/4[1]。Ⅱ 型膠原主要存在于動(dòng)物的白色結(jié)締組織中[2]，由3條相同的α1（Ⅱ）鏈以超螺旋的方式構(gòu)成軟骨的基本結(jié)構(gòu)，具有維持關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗張力強(qiáng)度的功能[3]。Ⅱ 型膠原特有的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成使其在生物醫(yī)學(xué)材料、化妝品及食品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。近年來(lái)研究表明，Ⅱ 型膠原還可以作為藥物和保健品來(lái)防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）。

我國(guó)禽肉加工產(chǎn)量較高，每年在禽類加工過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生大量的雞胸軟骨等副產(chǎn)品。以往雞胸軟骨大多被當(dāng)作廢棄物直接丟棄或用作飼料生產(chǎn)，造成了環(huán)境污染和大量的資源浪費(fèi)。Ⅱ型膠原是雞胸軟骨中的主要成分。筆者以雞胸軟骨為原料，采用酶法提?、蛐湍z原并對(duì)其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行研究，旨在為充分利用雞骨資源、減少環(huán)境污染、解決禽類加工資源綜合利用等問(wèn)題，并獲得一種具有高附加值的生物活性物質(zhì)提供依據(jù)，具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸軟骨，市場(chǎng)購(gòu)買；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京博特森生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白（分子量6.5～270.0 kDa），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶（1 200 U/g），國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；透析袋（8 000～140 000 Da）；考馬斯亮藍(lán)G250、甲醇、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、乙酸、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等，均為分析純。

1.2 主要儀器

Agilent1100氨基酸分析儀，美國(guó)安捷倫公司；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；IS10傅立葉紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet公司；1658001 Bio-Rad伯樂(lè)Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽，美國(guó)Bio-Rad公司；UltrafleXtreme基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，布魯克·道爾頓公司；MOS-450圓二色光譜儀，法國(guó)Biologic公司；77530-30LABCONCO6L凍干機(jī)，照生有限公司；5424 Eppendorf臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf艾本德股份有限公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 膠原提取工藝流程。雞胸軟骨→清洗→去骨膜→切碎→脫脂→凍干→浸提→鹽析→透析→凍干→成品。

1.3.2 膠原提取步驟。

1.3.2.1 雞胸軟骨的預(yù)處理。

將冷凍的雞胸軟骨，用蒸餾水清洗干凈，去除骨膜，切成約2 mm×2 mm×2 mm的小塊，混懸于10%正乙烷中，攪拌，每8 h更換1次，連續(xù)浸泡24 h去脂。蒸餾水沖洗數(shù)次后，預(yù)凍，真空冷凍干燥48 h，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 膠原的提取。所有操作均在4 ℃條件下進(jìn)行。將凍干的雞胸軟骨，浸泡于含有1%（W/V）胃蛋白酶、料液比為1∶20的0.5 mol/L HAc溶液24 h[4]，用滴管逐滴加入溶解完全的NaCl溶液[5]，使NaCl最終濃度為0.9 mol/L，鹽析出絮狀物，4 000 r/min，10 min，棄去上清液體，沉淀即為粗制Ⅱ型膠原。將沉淀溶解于0.5 mol/L HAc溶液中，如此重復(fù)鹽析、沉淀、離心純化3次，使用分子截留量為8 000～14 000 Da的透析袋，用0.5 mol/L HAC透析72 h后，預(yù)凍，真空冷凍干燥后即為純化后的Ⅱ型膠原。將凍干的樣品保存在-20 ℃下備用。

1.3.2.3 提取率計(jì)算。膠原提取率=凍干所得的膠原質(zhì)量/雞胸軟骨質(zhì)量×100%。

1.3.3 膠原的檢測(cè)與結(jié)構(gòu)表征。

1.3.3.1 紫外光譜（UV）檢測(cè)法。

將樣品溶于0.05 mol/L HAc溶液中，配制成濃度為0.3 mg/mL的膠原溶液。以0.05 mol/L的HAc溶液作為空白，在190～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外光譜檢測(cè)。

1.3.3.2 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）檢測(cè)法。

將樣品與KBr固體（1∶100）混勻，研磨，壓片，使用傅里葉變換紅外光譜儀，于4 000～400 cm-1進(jìn)行掃描，分辨率為4 cm-1，掃描頻率為16次。

1.3.3.3 SDS-PAGE凝膠電泳。

按照Laemmli[6]將樣品溶于適量上樣緩沖液，配制成10 mg/mL的膠原溶液，煮沸3 min，自然冷卻，4 000 r/min離心10 min。采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)記，分離膠和濃縮膠分別為6%和5%，上樣量為4 μL。先于80 V電壓下電泳30 min，后于120 V下電泳100 min。電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min，脫色液脫色3～4次，每次30～40 min。

1.3.3.4 肽指紋圖譜。

按照“1.3.3.3”所述制備電泳凝膠。電泳結(jié)果表明，雞胸軟骨中膠原主要由一條較粗的α帶和一條較細(xì)的β帶構(gòu)成。為了進(jìn)一步證實(shí)膠原為 Ⅱ 型膠原，切除 α亞基，經(jīng)脫色、酶解、萃取、點(diǎn)樣后，通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定出各片段的準(zhǔn)確質(zhì)量，然后將獲得的數(shù)據(jù)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜尋、鑒定[7]。

1.3.3.5 氨基酸分析。

稱取100 mg樣品，溶于8 mL的6 mol/L HCl中，充氮?dú)? min，溶液呈微沸狀態(tài)，密封，120 ℃烘箱中水解22 h，加4.8 mL 10 mol/L NaOH中和，定容，雙層濾紙過(guò)濾，15 000 r/min，離心10 min，取上清液于氨基酸自動(dòng)分析儀分析。

1.3.3.6 圓二色譜。

將樣品溶于0.05 mol/L HAc溶液，配成濃度為0.3 mg/mL膠原溶液，在190～250 nm波長(zhǎng)下平均掃描3次；并在218 nm處對(duì)膠原溶液進(jìn)行溫度掃描，溫度為19～50 ℃，獲得膠原溶液的變性曲線，變性溫度即為變化率一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胸軟骨膠原的提取率 經(jīng)計(jì)算，雞胸軟骨膠原的提取率為0.11%（以濕重計(jì)）。

2.2 膠原的檢測(cè)與結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 UV檢測(cè)法。

雞胸軟骨的紫外吸收光譜如圖1所示。膠原的肽鏈中含有C=O、COOH、CONH2等生色基團(tuán)，可以在近紫外區(qū)檢測(cè)到吸收峰。從圖1可以看出，在217 nm處有一個(gè)最大吸收峰，與 Ⅱ 型膠原的紫外特征吸收峰較吻合。

2.2.2 FTIR檢測(cè)法。

圖2是雞胸軟骨中所提取的Ⅱ型膠原的傅里葉紅外光譜圖。由圖2可知，Ⅱ 型膠原的紅外圖譜有4個(gè)特征吸收峰，分別為3 370、2 930、1 640和1 540 cm-1，分別命名為酰胺 A帶、酰胺 B 帶、酰胺 I 帶和酰胺 Ⅱ 帶。一般情況下，酰胺A帶和酰胺B 帶主要是N-H 的伸縮振動(dòng)，酰胺I帶是C=O的伸縮振動(dòng)和N-H 的彎曲振動(dòng)，酰胺 Ⅱ 帶是 N-H 的彎曲振動(dòng)和 C-N 的伸縮振動(dòng)。將該紅外吸收?qǐng)D譜與文獻(xiàn)[8]中報(bào)道的天然Ⅱ型膠原的圖譜對(duì)照，該圖中的波數(shù)和吸收峰位置與其基本一致，說(shuō)明該研究中的提取工藝沒(méi)有破壞 Ⅱ 型膠原的天然結(jié)構(gòu)。

2.2.3 SDS-PAGE凝膠電泳法。

根據(jù)雞胸軟骨膠原的電泳結(jié)果（圖3），該試驗(yàn)提取的膠原樣品的譜帶顯示，與曹慧等[4]的電泳圖譜結(jié)果一致。圖中，樣品出現(xiàn)2個(gè)條帶，由于Ⅱ型膠原主要由3條相同的α1（Ⅱ）鏈構(gòu)成，所以電泳圖譜中出現(xiàn)一條含量較高的α帶和少量的β二聚體，二者的分子量分別位于130和250 kDa的位置。

2.2.4 肽指紋圖譜。雞胸軟骨膠原的肽指紋質(zhì)譜結(jié)果顯示，鑒定了膠原的α條帶，獲得注冊(cè)號(hào)為gi31340542，分子量/PI為120043/7.22，得到1%的重疊范圍，總評(píng)分為63分，一共有1個(gè)肽段相匹配。通過(guò)MALDI—TOF/TOF質(zhì)譜法分析了雞胸軟骨膠原的α條帶，結(jié)果中的分?jǐn)?shù)> 61表示同一性或廣泛同源性（P<0.05），結(jié)果可信。

2.2.5 氨基酸分析。

從雞胸軟骨膠原氨基酸組成（表1）可以看出，主要氨基酸是甘氨酸（250殘基/1 000氨基酸殘基），其次為谷氨酸（128殘基/1 000氨基酸殘基）、丙氨酸（101殘基/1 000氨基酸殘基）、羥脯氨酸（99殘基/1 000氨基酸殘基），符合Ⅱ型膠原的特征[9]。

2.2.6 圓二色譜。

圓二色譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種快速、簡(jiǎn)單的方法[10]。蛋白質(zhì)中氨基酸的α-碳原子是不對(duì)稱的，具有光學(xué)活性；蛋白質(zhì)的肽鏈走向也是不對(duì)稱的，也具有光學(xué)活性。當(dāng)平面偏振光通過(guò)這些光活性的生色基團(tuán)時(shí)，光活性中心對(duì)平面圓偏振光中的左右圓偏振光的吸收不相同，產(chǎn)生了吸收差值，由于這種吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圓偏振光變成了橢圓偏振光，這就是蛋白質(zhì)的圓二色性。一般蛋白質(zhì)的圓二色光譜分成兩段，波長(zhǎng)在185～245 nm 稱為遠(yuǎn)紫外區(qū)，245～320 nm 稱為近紫外區(qū)。遠(yuǎn)紫外區(qū)是蛋白質(zhì)肽鏈的吸收峰，反映了主鏈的構(gòu)象。

雞胸軟骨中提取的膠原在遠(yuǎn)紫外區(qū)的圓二色譜如圖4所示，197 nm處存在一個(gè)負(fù)峰，223 nm處存在一個(gè)正峰，說(shuō)明膠原三股螺旋保持較好，符合膠原三股螺旋典型特征的圓二色譜峰型。

物質(zhì)在溫度變化過(guò)程中，往往伴隨著微觀結(jié)構(gòu)、宏觀的物理和化學(xué)性質(zhì)等變化。膠原的熱變性溫度（Ts）是反映其天然螺旋結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)之一。當(dāng)體系的溫度達(dá)到Ts時(shí)，膠原分子從伸展的纖維態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)卷曲狀，即膠原變性為明膠。圖5是雞胸軟骨膠原的變性曲線，由圖可見，變性溫度為39 ℃。

3 結(jié)論

Ⅱ型膠原分子間通過(guò)交聯(lián)鍵相連使各分子間相互聚合成大分子穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，所以，Ⅱ型膠原是一種難溶性蛋白。這種特性阻礙了膠原的提取。鑒于以上情況，試驗(yàn)選用酸溶液-胃蛋白酶體系，使之成為可溶性并保持膠原分子的完整性。該試驗(yàn)采用酶法對(duì)雞胸軟骨膠原進(jìn)行提取，并對(duì)其進(jìn)行UV、FTIR、SDS-PAGE和CD等檢測(cè)，證明所提膠原為Ⅱ 型膠原。我國(guó)是養(yǎng)雞大國(guó)，雞胸軟骨產(chǎn)量較大，但作為禽產(chǎn)品加工的主要副產(chǎn)物并沒(méi)有得到充分的開發(fā)和利用，因此開發(fā)利用雞胸軟骨資源用以生產(chǎn)Ⅱ型膠原，提高其附加值，具有極大的經(jīng)濟(jì)意義。

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