保健食品中總皂苷測定方法研究

劉花梅 杜裕芳 鄒敏 楊梅

摘要 [目的]找出一種準確、簡捷的測定方法，應(yīng)用于保健食品的日常檢測。[方法]以香草醛-高氯酸為顯色劑，采用紫外分光光度計標準曲線外標法測定。[結(jié)果]標準曲線法測定的線性范圍為0.020～0.250 mg/mL，決定系數(shù)R2=0.998 9，在不同的保健食品中平均加標回收率均在95.8%～104.2%，RSD≤3.0（n=6）。[結(jié)論]該方法簡便快捷、準確、靈敏度高、重復(fù)性好，達到檢驗分析的要求，具有實用推廣價值。

關(guān)鍵詞 保健食品；總皂苷；紫外分光光度計標準曲線外標法

中圖分類號 TS207文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）15-0163-04

Abstract [Objective] The research aimed to find an accurate and simple determination method， which is applied to the daily detection of healthone.[Method] Using vanillin-perchloric acid as a color reagent， UV spectrophotometer standard curve external standard method was used for the determination.[Result]The linear range of the standard curve method was 0.020-0.250 mg/mL， and the determination coefficient was 0.998 9. The average standard recovery rate was 95.8%-104.2% in different healthone， and the RSD was less than 3.0 （n=6）.[Conclusion]The method is simple， quick， accurate， high sensitivity， good reproducibility， meets the requirements of inspection and analysis， and has practical application value.

Key words Healthone；Total saponins；UV spectrophotometer standard curve external standard method

目前有大量的以中草藥為主要原料的保健食品，其中有以人參和西洋參為原料的產(chǎn)品，其主要活性成分為總皂苷，具有抗疲勞、促進記憶、保護心血管系統(tǒng)等作用，為保健食品中的功能性成分?？傇碥盏姆治龇椒ㄝ^多，有高效液相色譜法[1] 、超高壓液相測定技術(shù)[2]、近紅外光譜技術(shù)[3]、紫外分光光度法[4-7]、比色法等，高效液相色譜法、超高壓液相測定技術(shù)、近紅外光譜技術(shù)檢測結(jié)果精準，但操作步驟較繁瑣、耗時、費用較高；紫外分光光度法較簡便迅速費用較少，應(yīng)用較廣泛。筆者在《保健食品檢驗規(guī)范與評價技術(shù)規(guī)范》中保健食品中總皂苷測定方法[8]的基礎(chǔ)上對費時費力、容易引起誤差的操作步驟進行研究改進，采用超聲提取[9-11]、大孔樹脂分離純化[12]、真空旋轉(zhuǎn)濃縮蒸干，以人參皂苷Re為標準品，采用標準曲線法檢測各種保健食品中的人參總皂苷含量，建立一個準確、簡捷的測定方法，對保健食品中總皂苷含量進行有效控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品。江西6家生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的12批保健食品，包括西洋參川貝枇杷膏、靈芝洋參膠囊、無糖型西洋參含片、養(yǎng)鹿人牌參茸枸杞酒、高麗參茶、洋參蜂王漿凍干粉膠囊、西洋參氨基酸口服液、靈芝蛹蟲草茯苓酸棗仁顆粒、黃芪白術(shù)西洋參口服液、鹿茸人參酒、西洋參提取物、人參粉。

1.1.2 儀器。紫外可見分光光度計（島津UV-2600）；層析柱（直徑1.5 cm，長度20 cm）；雙頻數(shù)控超聲波清洗器（KQ-300VDE型）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空控制系統(tǒng)（V-300+L-300）；sartorius電子天平；恒溫水浴鍋。

1.1.3 試劑。XAD-2大孔樹脂（SUPELCO Bellefonte，PA），使用前應(yīng)先用乙醇浸泡1～2 h進行充分激活，然后再用大量清水反復(fù)洗滌4～6次，至樹脂中已無明顯乙醇氣味時方可使用。中性氧化鋁，100～200目；人參皂苷Re標準品（中國食品藥品檢定研究所，含量97.4 %，批號110754-201626）；乙醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸為分析純。水為蒸餾水，經(jīng)Millipore純水處理系統(tǒng)純水所得。

1.2 方法

1.2.1 試樣處理。

1.2.1.1 固體試樣。稱取適量樣品（根據(jù)試樣含總皂苷量而定），精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加少量水，超聲30 min，冷卻至室溫，用水定容至100 mL，搖勻，過濾，吸取1.0 mL續(xù)濾液進行柱析層。

1.2.1.2 液體試樣。含乙醇的保健酒類等，吸取1.0 mL試樣放水浴揮干，用水溶解殘渣，用此液進行柱層析。非乙醇類的液體保健食品，吸取試樣1.0 mL樣品（濃度高或顏色深則稀釋后再取1.0 mL）進行柱層析。

1.2.2 柱層析。取層析柱，內(nèi)裝3 cm XAD-2大孔樹脂，上加1 cm中性氧化鋁。預(yù)處理先用25 mL 70%乙醇洗柱棄去洗脫液，再用25 mL水洗柱棄去洗脫液。預(yù)處理完畢后，精密量取1.0 mL已處理好的“1.2.1”中試樣溶液至層析柱，用25 mL水洗柱棄去洗脫液，用25 mL 70%乙醇洗脫人參皂苷，收集洗脫液于50 mL的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空控制系統(tǒng)（真空150 mbar保持10 min，50 mbar 30 min；溫度60 ℃）濃縮至干。

1.2.3 顯色。在上述濃縮至干的回流瓶中加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，轉(zhuǎn)動回流瓶，使殘渣全部溶解，再加0.8 mL高氯酸，混勻后移入10 mL帶塞刻度離心管中，60 ℃水浴加熱10 min，取出，冰浴2 min冷卻后，準確加入冰乙酸5.0 mL，搖勻后待測。

1.2.4 標準溶液的制備。精密稱取人參皂苷Re標準品20 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得人參皂苷Re標準溶液0.2 mg/mL。精密量取人參皂苷標準溶液（0.2 mg/mL）0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.25 mL分別濃縮至干，按“1.2.3”進行顯色。

1.2.5 上機測定。按照紫外分光光度法，以1 cm的比色池于560 nm波長處分別對上述空白試劑、標準溶液、樣品的顯色液進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

取標準系列溶液，按照“1.2.5”方法測定，以吸光度為橫坐標、人參皂苷Re含量（mg/mL）為縱坐標繪制標準曲線，得出回歸方程為y=0.250 2x+0.010 5（R2=0.998 9），表明總皂苷（以人參皂苷Re計）在0.020～0.250 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.2 顯色后溶液穩(wěn)定性試驗

取樣品和標準溶液分別于顯色后5、10、20、30、45、60、90 min測定吸光度，顯色后樣品溶液和標準溶液30 min的RSD分別為2.87%和2.97%，45 min后RSD分別為4.75%和4.00%，結(jié)果顯示吸光度在45 min后明顯下降（表1）。因此顯色后應(yīng)在30 min內(nèi)測定完，以保證結(jié)果的準確性。

2.3 樣品含量測定

分別取12批次保健品，根據(jù)預(yù)估含量，調(diào)整取樣量和稀釋倍數(shù)，使樣品中總皂苷（以人參皂苷Re計）的量在0.020～0.250 mg/mL，測定結(jié)果均在企業(yè)標準規(guī)定的標示范圍內(nèi)（表2），與企業(yè)投料量基本一致，表明結(jié)果可靠。

2.4 加標回收率和重復(fù)性試驗

精密稱取樣品，分別加入樣品含量約50%、100%、150%的比例加標，按“1.2.2”和“1.2.3”進行層析和測定，并分別計算回收率，其中西洋參川貝枇杷膏的低、中、高比例分別加標6份樣品的平均回收率為100.8%、98.5%、101.1%，RSD分別為2.93%、2.67%、2.34%（表3）；靈芝洋參膠囊加標6份樣品平均回收率為99.7%，RSD為2.05%（表4）；無糖型西洋參含片加標6份樣品平均回收率為100.9%，RSD為2.05%（表5）；養(yǎng)鹿人牌參茸枸杞酒加標6份樣品平均回收率為98.6%，RSD為2.76%（表6）；高麗參茶加標6份樣品平均回收率為99.8%，RSD為2.51%（表7）；西洋參蜂王漿凍干粉膠囊平均回收率為98.8%，RSD為1.41%（表8）；西洋參氨基酸口服液加標6份樣品平均回收率為98.9%，RSD為2.83%（表9）；靈芝蛹蟲草茯苓酸棗仁顆粒加標6份樣品平均回收率為98.6%，RSD為2.89%（表10）。由此可見，各品種不同梯度的加標回收率均在95.8%～104.2%，RSD≤3%，表明該方法準確度良好。

3 討論

3.1 標準曲線的選擇

在現(xiàn)有的2003年版《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中，標準點僅測一個點，用的單點外標法，對于含量不一的樣品，其吸光度差異較大，對結(jié)果影響較大。該試驗采用標準曲線法，吸光度在0.020～0.250 mg/mL均能準確定量。

3.2 溫度和真空度的選擇

在現(xiàn)有的2003年版《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》和部分企業(yè)標準及現(xiàn)有的文獻中，將洗脫液收集于蒸發(fā)皿中，置于60 ℃水浴揮干，這個過程時間太長，常需要4～5 h才能揮干，費時費力。該試驗考察了60 ℃，真空度為150、100、50 mbar，發(fā)現(xiàn)真空150 mbar保持10 min，50 mbar保持30 min最省時省力，又不會引起暴沸導(dǎo)致?lián)p失，因此為了提高效率，故采用水浴60 ℃，真空150 mbar保持10 min，50 mbar保持30 min，濃縮至干。

3.3 測定時間的選擇

由于該試驗為顯色反應(yīng)，顯色后隨著時間的推移，吸光度變化很大，考察了標準溶液顯色24 h后，吸光度將會從0.720 0降至0.361 2，因此應(yīng)嚴格控制測定時間，樣品顯色后從60 ℃水浴上取出，立即冰浴2 min，精密加入5 mL冰乙酸，搖勻后保證顯色完全，進行測定。該試驗考察了5、10、20、30、45、60、90 min的吸光度，發(fā)現(xiàn)要30 min內(nèi)完成測定，吸光度RSD小于3%，才能保證數(shù)據(jù)的準確性，減少誤差。

3.4 前處理方法的調(diào)整

該試驗用到的保健品包括片劑、膠囊、口服液、糖漿、酒類、粉劑、顆粒劑等，由于樣品的狀態(tài)和總皂苷含量不同，因此前處理方法稍有適當?shù)恼{(diào)整。稱量樣和稀釋倍數(shù)調(diào)整后，應(yīng)使顯色后測定的量在曲線范圍內(nèi)，保證結(jié)果的準確性。

4 結(jié)論

該試驗以香草醛-高氯酸為顯色劑，采用標準曲線外標法測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標準曲線法測定的線性范圍為0.020～0.250 mg/mL，決定系數(shù)R2=0.998 9，在不同的保健食品中平均加標回收率均在95.8%～104.2%，RSD≤3.0（n=6），表明該方法簡便快捷、準確、靈敏度高、重復(fù)性好，達到檢驗分析的要求，具有實用推廣價值。

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