不同濃度二甲雙胍對(duì)豬精液液態(tài)保存效果的影響

周佳勃 馬思楠 王娜

摘要 [目的]研究不同濃度二甲雙胍對(duì)豬精液液態(tài)保存效果的影響。[方法]在豬精液液態(tài)保存液中分別添加不同濃度（0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L）的二甲雙胍，測定不同保存時(shí)間精子的活力、活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率等指標(biāo)。[結(jié)果]豬精液液態(tài)保存第3天，在不同濃度二甲雙胍作用下各組間精子活力出現(xiàn)差異。第5天，添加1.0 mmol/L二甲雙胍的保存液保存的精子活力達(dá)到38.03%，精子活率為49.03%，質(zhì)膜完整率為43.91%，頂體完整率為50.88%，均高于對(duì)照組。[結(jié)論]添加二甲雙胍有助于提高液態(tài)保存豬精液的質(zhì)量，延長保存時(shí)間。

關(guān)鍵詞 豬精液；液態(tài)保存；二甲雙胍；活力

中圖分類號(hào) S852.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）20-0077-03

Abstract [Objective] To study the influences of different concentrations of metformin on the liquid storage effect of boar sperm.[Method]Different concentrations（0.5，1.0，2.0，4.0 mmol/L） of metformin was added in the liquid storage liquid of boar sperm to detect the sperm motility，viability，plasma membrane integrity rate and acrosome integrity rate and other indices.[Result] On the third day，there was difference of sperm motility among different groups with different concentrations of metformin.On the 5th day， the sperm motility stored in the preservation liquid with adding 1.0 mmol/L metformin reached 38.03%，and the sperm viability was 49.03%，and plasma membrane integrity and acrosome integrity were 43.91% and 50.88% respectively，which were all higher than those of control group.[Conclusion] Metformin was beneficial to improve the quality of boar semen in liquid storage and prolong the preservation time.

Key words Boar sperm；Liquid storage；Metformin；Motility

豬人工授精技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)，由于豬精子對(duì)低溫特別敏感，目前所用精液大多為新鮮精液或液態(tài)保存的精液。隨著保存時(shí)間的延長，豬精子質(zhì)量顯著下降，受精能力降低，從而造成母豬的受胎率低、窩產(chǎn)仔數(shù)少，嚴(yán)重制約豬液態(tài)保存精液的應(yīng)用。因此，深入研究豬精液液態(tài)保存的關(guān)鍵技術(shù)，延長精子的保存時(shí)間，探討影響豬液態(tài)保存精子活率及受精能力的因素，進(jìn)一步提高受胎率和產(chǎn)仔數(shù)，已成為國內(nèi)外養(yǎng)豬生產(chǎn)中亟待解決的問題[1]。

精子液態(tài)保存過程中存在低水平的代謝活動(dòng)，這對(duì)于保障精子能量供給，特別是對(duì)精液的長期保存十分重要。在生產(chǎn)實(shí)踐中，為了降低精子對(duì)“冷打擊”的應(yīng)激，精液稀釋液中的葡萄糖濃度常常高于輸卵管液中的濃度，例如常用的BTS稀釋液含有205 mmol/L葡萄糖[2]。改善保存過程中豬精子對(duì)葡萄糖的利用，減輕降溫和稀釋產(chǎn)生的應(yīng)激對(duì)精子能量代謝的影響，延長精子壽命，對(duì)于提高精液質(zhì)量十分重要。

二甲雙胍是一種胰島素增敏劑，是目前臨床上治療二型糖尿病的重要藥物，可通過多種途徑起到降糖、降脂的作用，能提高細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用效率，改變細(xì)胞的能量代謝狀態(tài)，提高細(xì)胞糖酵解能力[3]。大量研究表明，糖尿病及肥胖導(dǎo)致男性生殖能力衰退，精子的質(zhì)量及數(shù)量出現(xiàn)下降。二甲雙胍可以有效緩解糖代謝紊亂造成的大鼠睪丸生精功能異常[4]。然而，關(guān)于二甲雙胍對(duì)公豬生殖能力，特別是體外精子液態(tài)保存的影響鮮見報(bào)道。筆者在豬精液保存液中添加不同濃度的二甲雙胍，對(duì)精子活力、活率、質(zhì)膜完整率以及頂體完整率等指標(biāo)進(jìn)行檢測，分析不同濃度二甲雙胍對(duì)豬精液液態(tài)保存的影響，旨在為研制豬精液液態(tài)保存液及提高種公豬的利用效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)動(dòng)物為哈爾濱市阿城區(qū)實(shí)驗(yàn)基地豬場的健康可育長白種公豬。

1.1.2 主要試劑。為了便于后續(xù)能量代謝研究，采用含有3 mmol/L葡萄糖、成分簡單的PBS為基礎(chǔ)保存液，配制基礎(chǔ)保存液：136 mmol/L氯化鈉（NaCl）、2.68 mmol/L氯化鉀（KCl）、8.1 mmol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、1.47 mmol/L 磷酸二氫鉀（KH2PO4）、0.1 mmol/L聚乙烯醇（PVA）、3 mmol/L葡萄糖、50 IU/mL 青霉素鈉、1.0 g/L鏈霉素（Streptomycin）；pH 7.4、滲透壓280 mOsm。低滲液：4.9 g檸檬酸三鈉、9.0 g果糖，溶于1 000 mL三蒸水中（100 mOsm）。分裝后在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。試?yàn)所用藥品購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 精液采集與保存。采用手握法采集濃厚部精液，溫度保持在32～35 ℃ ，1 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。選取精子的活力≥ 80%以上用于試驗(yàn)。在30 min內(nèi)降至室溫，離心去除精漿；然后分別用含有不同濃度（0.5、1.0、2 .0、4.0 mmol/L）二甲雙胍的保存液稀釋，不含二甲雙胍的處理為對(duì)照組，分裝到1.8 mL 凍存管中，精子的最終濃度為3×107～5×107 ind./mL。將凍存管置于17 ℃ 恒溫保存箱中保存，每隔24 h取樣并進(jìn)行檢測。

1.2.2 精子的活力及活率。在檢測前將樣本混勻，并置于37 ℃ 溫箱中預(yù)熱20 min。使用清華同方精子活力檢測系統(tǒng)（MX7.5）檢測精子的各項(xiàng)參數(shù)。取樣10 μL涂在計(jì)數(shù)池上，使用相差顯微鏡（200×）檢測精子的活力，每次檢測6個(gè)視野，精子計(jì)數(shù)數(shù)量不少于200個(gè)。在計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)中記錄精子的其他參數(shù)，包括平均曲線運(yùn)動(dòng)速度參數(shù)（VCL）、平均直線運(yùn)動(dòng)速度參數(shù)（VSL）、直線運(yùn)動(dòng)比率參數(shù)（LIN）、平均運(yùn)動(dòng)速率參數(shù)（VAP）。

1.2.3 質(zhì)膜完整率檢測。通過低滲試驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)膜完整率檢測[5]。取10 μL精子樣本加入到100 μL低滲液（150 mOsm/L）中并混勻，在37 ℃恒溫箱中孵育45 min，在孵育后的混合液中加入200 μL 4%戊二醇。取適量的混合液涂片，在相差顯微鏡（400×）下檢測腫脹和彎尾精子的百分率，每次計(jì)數(shù)不應(yīng)少于200個(gè)精子。

1.2.4 頂體完整率檢測。通過FITC-PNA染色試驗(yàn)對(duì)精子進(jìn)行頂體完整率檢測[6]。取200 μL精液樣本，2 000 r/min離心4 min，去除上清液并用0.5 mL PBS緩沖液對(duì)其進(jìn)行重懸，重復(fù)2～3次。用0.5 mL PBS重懸后，在重懸液中取出10 μL進(jìn)行涂片。室溫晾干后，用4%多聚甲醛固定20 min，用PBS緩沖液洗滌2次，每次5 min。然后，用FITC-PNA染料進(jìn)行避光染色30 min，用PBS緩沖液將其沖洗并室溫晾干，在倒置熒光顯微鏡（400×）下進(jìn)行檢測，每次鏡檢精子數(shù)不應(yīng)少于200個(gè)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。精子活力、活率、運(yùn)動(dòng)參數(shù)、質(zhì)膜完整率、頂體完整率均進(jìn)行單因素方差分析，每個(gè)處理重復(fù)3次。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度二甲雙胍對(duì)精子活力的影響

由表1可知，豬精液保存過程中各組精子的活力均隨保存時(shí)間的延長而逐漸下降。在保存第3天，各組間精子活力出現(xiàn)差異。保存第5天，添加1.0 mmol/L二甲雙胍的處理精子活力（38.03%）高于其他濃度處理（P < 0.05），顯著高于對(duì)照組（CK）（32.46%），而添加4.0 mmol/L二甲雙胍的處理精子活力低于其他濃度處理（29.61%）。

2.2 不同濃度二甲雙胍對(duì)精子活率的影響

由表2可知，隨著保存時(shí)間的延長，添加不同濃度的二甲雙胍均能提高精子活率。保存第5天，添加1.0 mmol/L二甲雙胍處理的精子活率為49.03%，顯著高于其他濃度處理（P<0.05）；當(dāng)二甲雙胍濃度為4.0 mmol/L時(shí)精子活率低于其他濃度處理。

2.3 不同濃度二甲雙胍對(duì)精子質(zhì)膜完整率的影響

頂體完整是精子完成受精的前提基礎(chǔ)。由表3可知，添加不同濃度的二甲雙胍均能提高精子的質(zhì)膜完整率，特別是添加1.0 mmol/L二甲雙胍處理的精子質(zhì)膜完整率（43.91%）顯著高于其他濃度處理（P<0.05）；當(dāng)二甲雙胍濃度為4.0 mmol/L時(shí)，精子質(zhì)膜完整率低于其他濃度處理。

2.4 在17 ℃液態(tài)保存下不同濃度二甲雙胍對(duì)精子頂體完整率的影響

由表4可知，精子液態(tài)保存過程中添加不同濃度的二甲雙胍均有助于提高精子的頂體完整率。第5天，添加1.0 mmol/L二甲雙胍處理的精子頂體完整率為50.88%，顯著高于其他濃度處理（P<0.05）；添加4.0 mmol/L二甲雙胍處理的精子頂體完整率顯著低于其他濃度處理（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

延長豬精液保存時(shí)間，提高種公豬的利用率，可以有效降低豬畜牧生產(chǎn)成本。因此，研究精子的能量代謝特點(diǎn)，提高精液保存質(zhì)量十分必要。大部分市售精液保存液中葡萄糖和果糖等能量物質(zhì)都是過量的，而且冷打擊和高倍稀釋情況下精子對(duì)能量物質(zhì)的利用能力也會(huì)下降。適時(shí)調(diào)整細(xì)胞的能量代謝模式對(duì)于精子存活十分重要。

二甲雙胍是一種治療二型糖尿病的重要藥物[3]，可促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用能力，改善細(xì)胞供能狀態(tài)。研究表明，二甲雙胍調(diào)解糖代謝作用主要體現(xiàn)在以下方面：增加葡萄糖的無氧酵解和利用，增加骨骼肌和脂肪組織的葡萄糖氧化和代謝；抑制肝糖的產(chǎn)生和輸出；改善外周組織胰島素與其受體的結(jié)合和受體后作用[7-8]。葡萄糖是精子液態(tài)保存過程中的重要供能物質(zhì)。張利[1]研究表明豬精子可通過葡萄糖酵解和有氧氧化代謝供能。Qiu等[9]在山羊精子保存過程中也有類似的報(bào)道。該研究采用含有3 mmol/L葡萄糖的PBS緩沖液作為基礎(chǔ)保存液，分別添加不同濃度的二甲雙胍，研究不同濃度二甲雙胍對(duì)體外豬精液液態(tài)保存效果的影響，結(jié)果表明二甲雙胍可顯著提高精子活力，在保存第5天，添加1.0 mmol/L二甲雙胍處理的精子活力仍維持在38.03%，顯著高于其他濃度處理。這表明在二甲雙胍的作用下精子運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，能量代謝得到改善，有利于延長精子壽命。精子活率檢測結(jié)果表明，二甲雙胍有利于精子的存活。保存第5天，添加1.0 mmol/L二甲雙胍處理的精子活率為49.03%，顯著高于對(duì)照組。該研究還發(fā)現(xiàn)，含有4.0 mmol/L的二甲雙胍保存液中精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)下降，精子活力低于其他濃度處理。這可能是由于過量的二甲雙胍誘導(dǎo)精子對(duì)葡萄糖過度利用，產(chǎn)生了大量的乳酸等物質(zhì)，造成pH下降，影響精子活力，縮短了精子壽命。邢月超[10]報(bào)道降低保存液的pH會(huì)導(dǎo)致精子活力下降。

精子質(zhì)膜和頂體完整是精子存活、完成受精及后續(xù)發(fā)育的重要條件。筆者研究了不同濃度二甲雙胍對(duì)精子質(zhì)膜和頂體完整率的影響。結(jié)果表明，不同濃度的二甲雙胍能夠提高保存精液中精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率。Luo等[11]研究表明二甲雙胍可通過激活A(yù)MPK通路調(diào)解脂肪細(xì)胞的有氧氧化和糖酵解能量代謝方式，減少ROS產(chǎn)生。過量的ROS會(huì)破壞精子膜上的多不飽和脂肪酸與磷脂，造成精子的質(zhì)膜損傷，會(huì)破壞頂體的完整性[12]。張利[1]研究表明在豬精子保存過程中，葡萄糖有氧氧化和酵解同時(shí)存在。據(jù)此推測，二甲雙胍很可能通過調(diào)解葡萄糖代謝方式，抑制了一些對(duì)精液保存不利的物質(zhì)（如ROS）的產(chǎn)生，從而保障精子質(zhì)膜和頂體的完整性。

綜上所述，二甲雙胍有利于提高豬精液的液態(tài)保存效果。在保存第5天，添加1.0 mmol/L二甲雙胍的保存液保存的精子活力、活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率等指標(biāo)均高于對(duì)照組。二甲雙胍可改變精子的能量供應(yīng)狀態(tài)，提高精子受精能力，延長保存時(shí)間。

參考文獻(xiàn)

[1] 張利.豬精子在液態(tài)保存過程中葡萄糖代謝的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014：1.

[2] JOHNSON L A，WEITZE K F，F(xiàn)ISER P，et al.Storage of boar semen[J].Anim Reprod Sci，2000，62（1/2/3）：143-172.

[3] 孫科.鹽酸二甲雙胍普通片和鹽酸二甲雙胍緩釋片治療2型糖尿病的成本-效果探析[J].中國醫(yī)藥指南，2016，14（30）：106.

[4] 閆文杰，穆楊，楊菁.二甲雙胍對(duì)肥胖大鼠睪丸生精功能的影響[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2018，39（1）：95-98.

[5] JEYENDRAN R S，VAN DER VEN H H，PEREZPELAEZ M，et al.Development of an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics[J].J Reprod Fertil，1984，70（1）：219-228.

[6] LEMOINE M，DUPONT J，GUILLORY V，et al.Potential involvement of several signaling pathways in initiation of the chicken acrosome reaction[J].Biol Reprod，2001，81（4）：657-665.

[7] 陳兆煜，王連唐，陳雁揚(yáng).二甲雙胍通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的抗腫瘤機(jī)制[J].中國肺癌雜志，2013，16（8）：427-432.

[8] WIERNSPERGER N F，BAILEY C J.The antihyperglycaemic effect of metformin：Therapeutic and cellular mechanisms[J].Drugs，1999，58（S1）：31-39.

[9] QIU J H，LI Y W，XIE H L，et al.Effects of glucose metabolism pathways on sperm motility and oxidative status during longterm liquid storage of goat semen[J].Theriogenology，2016，86（3）：839-849.

[10] 邢月超.穩(wěn)定pH值有助于延長豬精液保存時(shí)間[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017：33.

[11] LUO T，NOCON A，F(xiàn)RY J，et al.AMPK activation by metformin suppresses abnormal extracellular matrix remodeling in adipose tissue and ameliorates insulin resistance in obesity[J].Diabetes，2016，65（8）：2295-2310.

[12] 楊升，賈東平，劉家慧.抗氧化劑對(duì)豬精液冷凍保存效果的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，17（9）：50-53.