金寨紅陽獼猴桃提取物抗腫瘤及抑菌活性研究

陳金武 袁華玲 齊璐璐

摘要[目的]分析金寨紅陽獼猴桃提取物抗腫瘤及抑菌活性。[方法]采用水提法、醇提法提取金寨紅陽獼猴桃活性物質(zhì)。通過提取物對SH-SY5Y、HELA和MCF-7這3種腫瘤細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及生長抑制，測定其抗腫瘤活性。通過提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉以及酵母菌的生長抑制作用，分析其抑菌功能。[結(jié)果]金寨紅陽獼猴桃提取物能破壞3種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)添加量為20.0 μL時(shí)，對SH-SY5Y的抑制率為38%±6%，對HELA的抑制率為25%±5%，對MCF-7的抑制率為24%±3%。提取物添加量為40.0 μL時(shí)，可完全抑制大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的生長。提取物添加量為80.0 μL時(shí)對黑曲霉及酵母菌沒有明顯的抑制作用。[結(jié)論]金寨紅陽獼猴桃提取物能抑制腫瘤細(xì)胞及細(xì)菌的生長，可用于保健品及藥物的開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞 金寨紅陽獼猴桃；提取物；抗腫瘤；抑菌

中圖分類號 R285 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）22-0141-04

Abstract[Objective]The research aimed to study the antitumor and antimicrobial activity of Jinzhai Hongyang kiwi fruit extract.[Method]The active substances of Jinzhai Hongyang kiwi fruit were extracted by distilled water and ethanol respectively. The antitumor activity of the extract was measured by the destruction of the cell morphology and growth inhibition against SHSY5Y， HELA and MCF7. The growth inhibitory of the extract was also analyzed against Escherichia coli， Bacillus subtilis， Aspergillus niger and Saccharomyces.[Result]The kiwi fruit extract could destroy the morphology of three kinds of tumor cells. The inhibition rate of the extract against SHSY5Y was 38%±6% at the additive amount of 20.0 μL， and it was 25%±5% against HELA， which was 24%±3% against MCF7. The growth of escherichia coli and bacillus subtilis could be completely inhibited by the extract at the additive amount of 40.0 μL. The extract had no significant inhibition against aspergillus Niger and Saccharomyces at the additive amount of 80.0 μL.[Conclusion]Jinzhai Hongyang kiwi fruit extract can inhibit the growth of tumor cells and bacteria， and it can be used for the development of health care products and drugs.

Key words Jinzhai Hongyang kiwi fruit；Extract；Antitumor；Antimicrobial

獼猴桃屬于獼猴桃科獼猴桃屬，是一種落葉和半落葉的常綠藤本植物[1]。該水果中含有豐富的堿類、水解酶類、果膠類、糖類物質(zhì)以及維生素C等活性物質(zhì)，具有清熱、利尿、促進(jìn)血液循環(huán)、治療肝炎以及抗腫瘤等作用[2]。金寨獼猴桃是安徽省六安市金寨縣特產(chǎn)，其主要品種有紅陽、海沃德等適生品種，當(dāng)?shù)卣恢苯o予大力支持，使得獼猴桃產(chǎn)業(yè)已成為該地重要的支柱產(chǎn)業(yè)之一。

目前，將獼猴桃運(yùn)用于醫(yī)藥保健品的開發(fā)已成為農(nóng)學(xué)及生命科學(xué)的研究新熱點(diǎn)[3]。人們已發(fā)現(xiàn)獼猴桃對促進(jìn)神經(jīng)末梢的生長恢復(fù)有一定的幫助[4]。此外，獼猴桃中的某些物質(zhì)可以通過激活機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶來清除自由基，延緩機(jī)體衰老，其中多酚與其清除自由基的能力相關(guān)[5]。除了獼猴桃果實(shí)外，獼猴桃根同樣具有多種功效[6]。Montefiori等[7]研究表明利用獼猴桃給予機(jī)體抗氧化劑，降低機(jī)體氧化速度，能夠減緩惡性腫瘤的生長。筆者對金寨紅陽獼猴桃提取物進(jìn)行功能探究，分析其抗腫瘤及抑菌活性，挖掘獼猴桃藥用價(jià)值，以期為當(dāng)?shù)孬J猴桃的產(chǎn)品加工與開發(fā)提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 儀器

Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；DS-1高速組織搗碎機(jī)（廣東罡然機(jī)電設(shè)備有限公司）；HXQ-QB全溫振蕩培養(yǎng)箱（常州恒隆儀器有限公司）；IX71+DP72倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯株式會社）；Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；SW-CJ-2FD雙人單面超凈臺（蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 試材

金寨紅陽獼猴桃，安徽潤生農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y、人宮頸癌細(xì)胞HELA、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌Bacillus.subtilis、黑曲霉Aspergillus niger、酵母菌Saccharomyces，合肥師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液，北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基噻唑藍(lán)（MTT），上海源葉生物科技有限公司；其余生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 獼猴桃活性物質(zhì)提取液的制備。

1.3.1.1

水提法。將金寨紅陽獼猴桃洗凈去皮，精準(zhǔn)稱量獼猴桃果肉50 g，置于研缽中研磨破碎。添加200 mL去蒸餾水，85 ℃加熱4 h。取加熱后物質(zhì)進(jìn)行過濾留濾液，于3 000 r/min離心10 min，留上清并靜置1 d。再次3 000 r/min離心10 min，留上清得獼猴桃水提物。

1.3.1.2

乙醇提取法。按“1.3.1.1”研磨獼猴桃果肉，添加200 mL 95%乙醇浸泡48 h，過濾留濾液。將濾液于3 000 r/min離心10 min，留上清并靜置1 d。再次3 000 r/min，離心10 min，留上清得獼猴桃乙醇提取物。

1.3.1.3 活性物質(zhì)提取液的制備。

將上述2種方法制備的提取物按照1∶1 比例進(jìn)行混合后即制成獼猴桃活性物質(zhì)提取液，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.2

獼猴桃提取物抗腫瘤活性分析。

1.3.2.1

獼猴桃提取物對腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響。將培養(yǎng)至正常生長狀態(tài)的SH-SY5Y、HELA、MCF-7 3種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行消化。吸取20 μL細(xì)胞懸液于滅菌后EP管中，加入980 μL DMEM血清培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL細(xì)胞稀釋液待用。每種細(xì)胞設(shè)置4個(gè)待測組：高劑量組，每孔加入20 μL獼猴桃提取物；低劑量組，每孔加入5 μL獼猴桃提取物；空白組，不加入提取液；乙醇組，加入20 μL 49.5%乙醇，即活性物質(zhì)提取所用溶劑。用DMEM血清培養(yǎng)基將每孔補(bǔ)齊至終體積為200 μL。將96孔板放于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.3.2.2

腫瘤細(xì)胞抑制率測定。采用MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率[8]。參照“1.3.2.1”對生長狀況良好的SH-SY5Y、HELA、MCF-7這3種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行消化并稀釋。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL細(xì)胞稀釋液待用。藥物組：每孔分別加入2.5、5.0、10.0、20.0 μL獼猴桃提取物；空白組，不加入提取液；乙醇組，加入20 μL 49.5%乙醇。用DMEM血清培養(yǎng)基將每孔補(bǔ)齊至終體積為200 μL。將細(xì)胞樣本置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h后吸去每孔液體，加入MTT溶液100 μL，在CO2培養(yǎng)箱中溫育4 h后終止培養(yǎng)。棄上清液，然后加入150 μL DMSO，振蕩15 min，于490 nm處檢測吸光度。根據(jù)公式抑制率=（A0-A1）/A0×100%計(jì)算獼猴桃提取物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率。其中，A0為空白組細(xì)胞吸光度；A1為加入不同獼猴桃提取物的細(xì)胞吸光度。

1.3.3

獼猴桃提取物抑制細(xì)菌生長活性分析。將保種的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌分別接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)，挑取活化菌落。將活化菌落轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期待用。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入99 μL LB液體培養(yǎng)基，并加入1 μL上述待用菌液。每孔分別加入10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μL獼猴桃提取液，用LB培養(yǎng)基將每孔補(bǔ)齊至200 μL。同時(shí)設(shè)置空白組（不加獼猴桃提取液組）、乙醇組（加入100 μL 49.5%乙醇）。上述每孔設(shè)置3個(gè)平行。將孔板置于37 ℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。分別培養(yǎng)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，檢測樣品在OD600處的吸光度，繪制生長曲線。

1.3.4

獼猴桃提取物抑制真菌生長活性分析。將保種的酵母菌、黑曲霉分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基），30 ℃倒置過夜培養(yǎng)，挑取活化菌落。參照“1.3.3”配制試驗(yàn)體系。將孔板置于30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)。分別培養(yǎng)0、4、8、12、16、18、24、28 h，檢測樣品在OD660處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃提取物抗腫瘤活性分析

2.1.1 獼猴桃提取物對SH-SY5Y、HELA、MCF-7細(xì)胞形態(tài)的影響。

將生長狀況良好的腫瘤細(xì)胞鋪到96孔板中，分別添加高劑量20 μL或低劑量5 μL獼猴桃提取物，然后置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)。從圖1～3可看出，空白組3種細(xì)胞生長狀態(tài)均良好，貼壁生長，外形完整，大小相近；分別添加高、低劑量獼猴桃提取物則對細(xì)胞形態(tài)造成影響；經(jīng)提取物處理的腫瘤細(xì)胞逐漸變圓，外形殘缺不完整，最后逐漸脫落，直至細(xì)胞死亡；隨著獼猴桃提取物劑量升高，細(xì)胞脫落的數(shù)量也相應(yīng)增加，表明獼猴桃提取物能夠在一定程度誘導(dǎo)SH-SY5Y、HELA和MCF-7的凋亡。

單獨(dú)添加與高劑量提取物同等濃度的乙醇（乙醇組），對細(xì)胞形態(tài)沒有明顯影響，表明提取物中所含乙醇對細(xì)胞形態(tài)沒有破壞作用。

2.1.2 獼猴桃提取物對SH-SY5Y增殖抑制。

MTT法可以用來測量細(xì)胞抑制率，了解細(xì)胞的凋亡。從圖4可看出，獼猴桃提取物能夠抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生長；當(dāng)提取物添加量為20.0 μL時(shí)，其對SH-SY5Y的抑制率為38%±6%，隨著提取物添加量的降低，其對SH-SY5Y的抑制作用逐漸下降；當(dāng)添加量降低至2.5 μL時(shí)，抑制率降至8%。乙醇對SH-SY5Y生長抑制率僅為2%，影響較小。

2.1.3 獼猴桃提取物對HELA增殖抑制。

按照“1.3.2.2”方法檢測提取物對HELA的抑制作用，結(jié)果如圖5所示。獼猴桃提取物能夠抑制HELA的生長；當(dāng)提取物添加量為20.0 μL時(shí)，其對HELA的抑制率為25%±5%；隨著提取物添加量的降低，其抑制作用逐漸下降；當(dāng)提取物添加量為2.5 μL時(shí)，抑制率為1%。乙醇對HELA抑制率相對較低，可以忽略提取物中乙醇對細(xì)胞的抑制效果。

2.1.4 獼猴桃提取物對MCF-7增殖抑制。

按照“1.3.2.2”方法檢測提取物對MCF-7的抑制作用，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)提取物添加量為20.0 μL時(shí)，其對MCF-7的抑制率為24%±3%；當(dāng)添加量為2.5 μL時(shí)，抑制率為1%。乙醇對MCF-7抑制率低。

比較3種細(xì)胞，SH-SY5Y對獼猴桃提取物最為敏感，抑制率最高；HELA與MCF-7相似。另外，乙醇對腫瘤細(xì)胞生長有較低的抑制率，影響較小，可以忽略提取物中乙醇對細(xì)胞的抑制效果。

2.2 獼猴桃提取物抑制細(xì)菌活性分析

2.2.1 獼猴桃提取物抑制大腸桿菌活性。

將活化的大腸桿菌接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入不同濃度梯度的獼猴桃提取液，補(bǔ)齊培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)檢測大腸桿菌OD600的吸光度，繪制生長曲線。從圖7可看出，隨著提取物添加量的增加，大腸桿菌的生長受到抑制。

添加量為10.0 μL時(shí)，大腸桿菌受到輕微抑制，但仍快速生長；當(dāng)添加量為20.0 μL時(shí)，其生長受到明顯抑制，生長速度遠(yuǎn)低于對照組；添加量高于40.0 μL時(shí)，大腸桿菌受到完全抑制，曲線沒有明顯升高。

乙醇對照組對大腸桿菌的抑制效果介于加入10.0～20.0 μL 獼猴桃提取物之間，說明雖然獼猴桃提取物中所含乙醇會在一定程度上抑制細(xì)菌生長，但效果較弱。

2.2.2 獼猴桃提取物抑制枯草芽孢桿菌活性。

將活化的枯草芽孢桿菌接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入不同濃度梯度的獼猴桃提取液，補(bǔ)齊培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并繪制生長曲線。從圖8可看出，添加量為10.0 μL時(shí)，枯草芽孢桿菌生長受到輕微抑制；當(dāng)添加量為20.0 μL時(shí)，枯草芽孢桿菌生長速度遠(yuǎn)低于對照組；添加量高于40.0 μL時(shí)，枯草芽孢桿菌受到完全抑制，曲線沒有明顯升高。

孢桿菌的生長抑制作用逐漸增強(qiáng)。同時(shí)，雖然獼猴桃提取物中所含乙醇會在微弱程度上抑制細(xì)菌生長，但效果較弱，提取物的抑菌作用主要來自于獼猴桃活性物質(zhì)。

2.3 獼猴桃提取物抑制真菌活性分析

將活化的黑曲霉、酵母菌分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入不同濃度梯度的獼猴桃提取液，補(bǔ)齊PDA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)檢測2種真菌在OD660的吸光度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加至80.0 μL 提取物的樣品，吸光度并未明顯低于空白組，說明獼猴桃提取物在添加量為10.0～80.0 μL，對于黑曲霉、酵母菌沒有明顯的抑制作用。

3 結(jié)論與討論

對于水果和蔬菜中活性物質(zhì)的研究是當(dāng)代農(nóng)學(xué)及生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。其中金寨紅陽獼猴桃富含各種活性物質(zhì)，具有多種生理活性。該研究采用水提法和醇提法提取金寨紅陽獼猴桃活性物質(zhì)。通過添加提取物，分析其對SH-SY5Y、HELA、MCF-7這3種腫瘤細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長狀態(tài)的影響；同時(shí)通過其對細(xì)菌及真菌的生長抑制，分析其抑菌效果。結(jié)果表明，獼猴桃提取物能破壞腫瘤細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并抑制腫瘤細(xì)胞的生長。當(dāng)添加量為20.0 μL時(shí)，其對SH-SY5Y的抑制率為38%±6%，對HELA的抑制率為25%±5%，對MCF-7的抑制率為24%±3%。同時(shí)，隨著添加量的增大，獼猴桃提取物抑制大腸桿菌及枯草芽孢桿菌生長的作用逐漸增強(qiáng)；添加量達(dá)到40.0 μL時(shí)，可完全抑制2種細(xì)菌的生長。但其添加量對黑曲霉及酵母菌的生長則無明顯抑制。該研究為金寨紅陽獼猴桃的活性分析提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)，為其深加工及抑癌、抑菌藥物的研發(fā)提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

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