蚯蚓體內(nèi)外分泌液的抗菌活性研究

張顯忠　張欣然　武曉雯　袁燕濤　郭東會(huì)

摘要 [目的] 探究蚯蚓體內(nèi)外分泌液的抗菌活性。[方法]分別將蚯蚓體內(nèi)外分泌液作用于不同的臨床致病菌株，篩選對(duì)體內(nèi)外分泌液的敏感菌種，并在此基礎(chǔ)上分析溫度、pH、蚯蚓體內(nèi)外分泌液濃度等因素對(duì)蚯蚓分泌液抗菌效果的影響。[結(jié)果] 蚯蚓體內(nèi)外分泌液均對(duì)金黃色葡萄球菌有良好的抗菌效果；誘發(fā)最佳抗菌效果的環(huán)境條件為：內(nèi)分泌液原液、30 ℃、pH 7～8；外分泌液原液、60 ℃、pH 7～8。[結(jié)論]研究結(jié)果為更好地開發(fā)與利用蚯蚓資源提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

關(guān)鍵詞 蚯蚓；分泌液；抗菌效果；金黃色葡萄球菌

中圖分類號(hào) S899.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）13-0095-03

Study on the Antibacterial Activity of Internal and External Secretory Fluid of Earthworm

ZHANG Xianzhong，ZHANG Xinran，WU Xiaowen et al

（School of Life Sciences，Taishan Medical University，Tai′an，Shandong 271000）

Abstract [Objective] To study the antibacterial activity of the internal and external secretory fluid of earthworm.[Method] The internal and external secretory fluid of earthworms were conducted on different clinical pathogens to screen out sensitive strains of internal and external secretory fluids .On this basis，the influences of temperature，pH，the concentration of internal and external secretory fluid of earthworms and other environmental factors on the antibacterial effect of secretory fluid of earthworm were analyzed.[Result] The internal and external secretory fluids of earthworm had good antibacterial effects on Staphylococcus aureus.The environmental conditions to induce the optimum antibacterial effect were as follows：the original liquid of the internal secretory fluid，30 ℃，pH 7-8；the original liquid of external secretory fluid，60 ℃，and pH 7-8.[Conclusion] The research results provided theoretical basis and practical basis for better exploitation and utilization of earthworm resources.

Key words Earthworms；Secretory fluid；Antibacterial effect；Staphylococcus aureus

蚯蚓通常生活在具有大量致病微生物的環(huán)境中，生命力極強(qiáng)且很少患病[1]。蚯蚓不僅作為分解者在生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位，降低工業(yè)造成的環(huán)境污染，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]，同時(shí)由于體內(nèi)存在多種抗菌成分，當(dāng)受到機(jī)械、電擊、化學(xué)及熱刺激時(shí)分泌的黃色分泌液中也含有抗菌肽等活性成分，具有較強(qiáng)的抑菌活性[3]。因此，蚯蚓不僅可作為優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白應(yīng)用于生產(chǎn)生活中，而且毒副作用小，在當(dāng)今抗藥性細(xì)菌泛濫的背景下更加安全環(huán)保的蚯蚓分泌液有望替代抗生素，具有巨大的生化藥理潛力。筆者通過敏感性測(cè)定試驗(yàn)篩選出對(duì)蚯蚓體內(nèi)外分泌液的敏感菌種，并分析了蚯蚓分泌液的抗菌效果以及環(huán)境因素對(duì)其影響，以期為更好地開發(fā)與利用蚯蚓資源提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 赤子愛勝蚓（Eisenia foetida），購(gòu)自眾翔蚯蚓養(yǎng)殖專業(yè)合作社。大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌，均由泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 蚯蚓外分泌液的提取。 取蚯蚓250 g，用清水反復(fù)沖洗，浸泡30 min，以便吐凈泥沙；再用無菌蒸餾水沖洗3～5次，用濾紙吸取體表多余水分。將蚯蚓于60 ℃水浴條件下熱刺激5～10 s[4]，待分泌出黃色分泌液后收集轉(zhuǎn)移至無菌50 mL離心管中，20 000 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)離心1次后，用一次性針式濾器過濾備用。

1.2.2 蚯蚓內(nèi)分泌液的提取。 取已提取外分泌液的蚯蚓250 g，瀝干體表水分，-12 ℃下預(yù)冷處理20 min，勻漿器研磨，將液體經(jīng)3層紗布過濾于50 mL離心管中，20 000 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)離心1次后，用一次性針式濾器過濾備用。

1.2.3 不同菌株對(duì)蚯蚓分泌液的敏感性測(cè)定。 取直徑5 mm的藥敏專用濾紙片，高壓滅菌干燥。吸取50 μL內(nèi)（外）分泌液，滴于濾紙片上。 制備大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌，菌液濃度均為15×108個(gè)/mL， 分別涂布于MH培養(yǎng)基[5]，并將上述含分泌液的濾紙片均勻貼到培養(yǎng)基上。置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18～20 h，試驗(yàn)重復(fù)3次，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值。

1.2.4 不同溫度對(duì)分泌液抗菌效果的影響。 采用熱刺激法提取蚯蚓外分泌液，設(shè)置外分泌液的溫度梯度分別為60、70、80、90、100 ℃；內(nèi)分泌液于室溫條件下提取，因此溫度梯度設(shè)置為30、40、50、60和70 ℃。

取5支10 mL無菌離心管，各加入蚯蚓外分泌液600 μL，分別在60、70、80、90、100 ℃下加熱10 min[6]。吸取50 μL各溫度梯度的外分泌液，滴于濾紙片上。將蚯蚓分泌液敏感菌株涂布在培養(yǎng)基上，濾紙片置于其中，每個(gè)培養(yǎng)基上做5個(gè)梯度，設(shè)置3次重復(fù)試驗(yàn)，觀察并測(cè)量抑菌圈的直徑，取平均值。另取5支10 mL無菌離心管，各加入蚯蚓內(nèi)分泌液600 μL，分別在30、40、50、60和70 ℃下加熱10 min。吸取50 μL各溫度梯度的內(nèi)分泌液，操作同上，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值。

1.2.5 不同濃度對(duì)分泌液抗菌效果的影響。排列6支試管，分別標(biāo)記為1～6，1號(hào)試管僅加入600 μL蚯蚓內(nèi)（外）分泌液作為對(duì)照，2～6號(hào)試管采用倍比稀釋法[7]進(jìn)行稀釋，濃度依次稀釋2、4、8、16、32倍，吸取50 μL各濃度梯度內(nèi)（外）分泌液，滴于濾紙片上。將濾紙片置于涂布有敏感菌的培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基做5個(gè)梯度，設(shè)置3次重復(fù)試驗(yàn)。觀察并測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值。

1.2.6 不同pH對(duì)分泌液抗菌效果的影響。配制不同pH緩沖溶液（pH 5的檸檬酸-檸檬酸鈉溶液，pH分別為6、7、8的PBS緩沖液，pH 9的碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液[8]；取各pH梯度緩沖液600 μL與蚯蚓內(nèi)（外）分泌液等量混合。吸取50 μL各pH梯度的內(nèi)（外）分泌液，滴于濾紙片上。將濾紙片置于涂布有敏感菌株的培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上做5個(gè)梯度，設(shè)置3次重復(fù)試驗(yàn)。觀察并測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株對(duì)蚯蚓分泌液的敏感性測(cè)定 由圖1可知，對(duì)蚯蚓內(nèi)、外分泌液最敏感的菌種均為金黃色葡萄球菌[9]，肺炎克雷伯菌效果次之，大腸埃希氏菌第三，而弗氏檸檬酸桿菌沒有任何現(xiàn)象產(chǎn)生。作用于同一菌種時(shí)，內(nèi)分泌液抑菌圈直徑均大于外分泌液抑菌圈直徑。究其原因，應(yīng)是由于提取方法不同所致。提取外分泌液時(shí)，水浴加熱可能破壞其中一部分有效成分，導(dǎo)致外分泌液的抑菌效果普遍稍弱于內(nèi)分泌液。

2.2 不同溫度對(duì)分泌液抗菌效果的影響 從圖2可以看出，對(duì)于內(nèi)分泌液，30～50 ℃時(shí)均有抑菌圈出現(xiàn)，其中30 ℃時(shí)抑菌圈最大，隨著溫度的升高，抑菌圈逐漸縮小，60 ℃時(shí)抑菌圈已完全消失。究其原因，可能是因?yàn)轵球緸樽儨貏?dòng)物，體溫會(huì)隨著外界環(huán)境的變化而上下波動(dòng)，有一定的耐受范圍，但隨著溫度的持續(xù)上升，高溫會(huì)破壞有效成分的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗菌能力消失[10]。從圖3可以看出，對(duì)于外分泌液，60～100 ℃時(shí)均有抑菌圈出現(xiàn)，60 ℃時(shí)抑菌圈最大，隨著溫度的升高，抑菌圈逐漸縮小。究其原因，可能是因?yàn)楦邷仄茐牧瞬糠钟行С煞值慕Y(jié)構(gòu)，使抑菌效果變差，但總體來看，外分泌液的熱穩(wěn)定性相對(duì)較高，當(dāng)溫度升至100 ℃時(shí)仍保留了部分抑菌活性。內(nèi)外分泌液對(duì)溫度表現(xiàn)出這樣的差異，可能是蚯蚓在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中與環(huán)境相互作用而逐步形成的，是自然選擇的結(jié)果[11]。

2.3 不同濃度對(duì)分泌液抗菌活性的影響 從圖4可以看出，蚯蚓內(nèi)、外分泌液均為蚯蚓原液的抑菌效果最明顯，

抑菌圈隨濃度的降低而逐漸縮小，至32倍時(shí)幾乎不可測(cè)，且同樣濃度的內(nèi)分泌液抑菌圈直徑略大于外分泌液。究其原因，可能與內(nèi)、外分泌液不同的提取方式有關(guān)[12]。

2.4 不同pH對(duì)分泌液抗菌活性的影響 從圖5可以看出，當(dāng)pH為5、7、8時(shí)蚯蚓內(nèi)外分泌液抑菌圈直徑較大，pH為6和9時(shí)抑菌圈直徑較小。究其原因，pH 7～8的環(huán)境與蚯蚓生活的土壤所需pH相近[13]，因此內(nèi)外分泌液的抗菌效果達(dá)到最大，而pH為5時(shí)出現(xiàn)一個(gè)明顯的峰值，可能與緩沖液本身有關(guān)，較低的pH抑制了金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，對(duì)內(nèi)外分泌液的抑菌產(chǎn)生一定的干擾。當(dāng)pH為9時(shí)，外分泌液的抑菌圈均略大于內(nèi)分泌液的抑菌圈，可能是由于內(nèi)分泌液比外分泌液對(duì)外界pH的改變更加敏感所致。

3 討論與結(jié)論

該研究改變了通過在恒溫箱內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間溶解來獲取蚯蚓內(nèi)分泌液的傳統(tǒng)方法，采用低溫勻漿器研磨，將溫度對(duì)蚯蚓內(nèi)分泌液中活性成分的影響降至最低，另外采用一次性針式濾器過濾蚯蚓分泌液，很大程度上排除了外源微生物對(duì)試驗(yàn)的干擾，提高了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。該研究證實(shí)了蚯蚓體內(nèi)外分泌液都具有較強(qiáng)的抑菌效果，但由于采用熱刺激法[14]提取蚯蚓外分泌液，一定會(huì)造成蚯蚓外分泌液中抗菌活性物質(zhì)的損失，總之蚯蚓內(nèi)分泌液的抗菌效果強(qiáng)于外分泌液，也從側(cè)面說明了溫度對(duì)蚯蚓分泌液抗菌效果的影響巨大。誘發(fā)蚯蚓分泌液發(fā)揮最大抗菌效果的環(huán)境條件如下：在30 ℃， pH 7～8時(shí)，蚯蚓內(nèi)分泌液原液的抗菌效果最佳；在60 ℃，

pH為7～8時(shí)，蚯蚓外分泌液原液的抗菌效果最佳。綜上所述，不論是在生產(chǎn)中還是生活中，在對(duì)蚯蚓分泌液進(jìn)行開發(fā)利用時(shí)，應(yīng)特別注意外部理化因素尤其是溫度對(duì)其帶來的干擾，選擇最優(yōu)條件，使其發(fā)揮出最大作用。

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