響應(yīng)面法優(yōu)化青蛤降血壓肽酶解制備工藝

詹秋桂 李杰煌 施鵬飛 雷鳴 羅李王 余方苗

摘要[目的]采用響應(yīng)面法優(yōu)化青蛤降血壓肽的酶解制備工藝。[方法]以青蛤肉為原料，木瓜蛋白酶為酶種，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇pH、酶解時(shí)間和料液比為影響因素，進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法分析3個(gè)因素對青蛤降血壓肽制備工藝的影響。[結(jié)果]木瓜蛋白酶酶解制備青蛤降血壓肽的最佳工藝條件為pH 5.8、酶解時(shí)間8.4 h、料液比1∶3.1，該條件下酶解產(chǎn)物對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制率達(dá)93.58%。[結(jié)論]該研究為青蛤的高值化利用和降血壓肽的制備提供了新思路。

關(guān)鍵詞青蛤；木瓜蛋白酶；降血壓肽；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）05-0007-03

Abstract[Objective]Enzymatic hydrolysis process for preparing antihypertensive peptides from Cyclina sinensis was optimized by using response surface methodology.[Method]Taking angiotensinconverting enzyme （ACE） inhibition rate as index，a 3factor and 3level BoxBehnken design coupled with response surface analysis was carried out to investigate the effects of pH，hydrolysis time and solidliquid ratio on ACE inhibition rate.[Result]The optimal conditions for preparing antihypertensive peptides from Cyclina sinensis by using papain were as followed：pH 5.8，hydrolysis time 8.4 h and solidliquid ratio1：3.1，and the ACE inhibition rate of enzymatic hydrolysates were up to 93.58% under these conditions.[Conclusion]This study provides novel ideas for the highvalue use of Cyclina sinensis and preparing antihypertensive peptides.

Key wordsCyclina sinensis；Papain；Antihypertensive peptides；Response surface methodology

我國成年人高血壓的發(fā)病率約為30%，血壓升高易引發(fā)腦卒中、心肌梗死、腎衰竭、冠心病等心血管疾病，每年因高血壓導(dǎo)致死亡人數(shù)高達(dá)200萬，防治高血壓成為研究的熱點(diǎn)[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 （ACE）通過催化血管緊張素 Ⅰ 轉(zhuǎn)化為血管緊張素 Ⅱ 和使緩激肽失活調(diào)節(jié)機(jī)體血壓，降血壓肽是一類具有ACE抑制作用的活性肽[2]。目前，臨床廣泛應(yīng)用人工合成的ACE抑制劑普利類藥物 （如卡托普利、依那普利和賴諾普利等）具有強(qiáng)降血壓作用，但長期服用會(huì)產(chǎn)生惡心、眩暈、劇烈咳嗽、腎功能損害等副作用[3]。因此，開發(fā)具有ACE抑制活性高、安全無毒副作用的活性物質(zhì)成為研究的熱點(diǎn)。

近年來，海洋生物蛋白通過酶解法制備ACE抑制肽的研究得到極大關(guān)注，目前，研究人員已從海洋魚類如鮭魚[4]、金槍魚[5]、太平洋鱈魚[6]，貝類如貽貝[7]、四角蛤蜊[8]，藻類如螺旋藻[9]、裙帶菜[10]等不同海洋來源蛋白[11]中制備分離出高活性的ACE抑制肽。青蛤（Cyclina sinensis）是廣泛分布于我國沿海常見的貝類，屬軟體動(dòng)物門雙殼綱簾蛤目簾蛤科。青蛤提取物具有抗氧化[12]、抗腫瘤[13]、降血壓[14]和提高機(jī)體免疫作用[15]等功效。筆者在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)對木瓜蛋白酶酶解青蛤制備ACE抑制肽的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期為進(jìn)一步從青蛤中制備、分離純化得到高活性 ACE抑制肽奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料。青蛤購于舟山老碶菜場；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶ACE （來源于兔肺）、馬尿酸和馬尿酰-組氨酰-亮氨酸 （N-Hippuryl-His-Leu，HHL）、三氟乙酸均購于Sigma公司；木瓜蛋白酶購于亞太恒信生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；硼砂、氯化鈉和硼酸等為國產(chǎn)分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2儀器。1260型高效液相色譜儀（HPLC），美國安捷倫公司；HH-6型恒溫水浴鍋，江蘇金壇市成輝儀器有限公司；Milli-A20型超純水系統(tǒng)，美國默克密理博公司；CF16RN型高速冷凍離心機(jī)，日立儀器有限公司；AUW-120型電子天平，日本島津（上海）有限公司；Delta-320型pH計(jì)，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1工藝流程。青蛤→去殼→清洗→勻漿→異丙醇脫脂→純水泡洗至無味→酶解→滅活→冷卻→離心取上清液→冷凍干燥→青蛤降血壓肽。

1.2.2青蛤酶解工藝。青蛤去殼取肉，洗凈勻漿并用異丙醇脫脂6 h，于12 000 r/min、4 ℃條件下離心8 min，收集沉淀，純水洗凈至無異丙醇味備用。稱取適量脫脂固體，選用木瓜蛋白酶，在溫度55 ℃、pH 6.0、料液比1∶3.0（g/mL）、時(shí)間8 h、加酶量2 000 U/g條件下進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后，于沸水浴中滅活15 min，冷卻至室溫后于12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，收集上清液，冷凍干燥得到青蛤降血壓肽。

1.2.3HPLC法檢測青蛤降血壓肽ACE抑制率。參照張艷萍等[7]報(bào)道的方法并根據(jù)試驗(yàn)條件進(jìn)行修改：取

120 μL 5.0 mol/L HHL溶液于1.5 mL離心管中，加入30 μL青蛤降血壓肽凍干粉溶液（5.0 mg/mL），混合均勻后于37 ℃恒溫水浴中預(yù)熱5 min，加入10 μL 0.1 U/mL ACE溶液，混合均勻后于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h，結(jié)束后加入150 μL 1.0 mol/L HCl淬滅反應(yīng)，得到抑制劑反應(yīng)液。用30 μL硼酸緩沖鹽溶液 （0.1 mol/L，pH 8.3，含0.3 mol/L NaCl）代替抑制劑提取液作空白對照組，樣品溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣到HPLC系統(tǒng)檢測。ACE抑制率計(jì)算公式為：

ACE抑制活性=（E-Y）/E×100%

式中，E為空白組中馬尿酸的峰面積（mAU·s）；Y為抑制劑組中馬尿酸的峰面積（mAU·s）[14]。

1.2.4單因素試驗(yàn)。在pH 6.0、加酶量2 000 U/g、料液比1∶3、時(shí)間8 h的條件下考察酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）對青蛤降血壓肽制備條件的影響；在pH 6.0、加酶量2 000 U/g、料液比1∶3.0、溫度55 ℃的條件下考察酶解時(shí)間（2、4、6、8、10 h）對青蛤降血壓肽制備條件的影響；在加酶量2 000 U/g、料液比1∶3.0、溫度55 ℃、時(shí)間8 h的條件下考察pH（4.0、5.0、6.0、7.0和8.0）對青蛤降血壓肽制備條件的影響；在pH 6.0、溫度55 ℃、料液比1∶3.0、時(shí)間8 h的條件下考察加酶量（1 000、2 000、3 000、4 000和5 000 U/g）對青蛤降血壓肽制備條件的影響；在pH 6.0、溫度55 ℃、時(shí)間8 h、加酶量2 000 U/g的條件下考察料液比（1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0和1∶5.0）對青蛤降血壓肽制備條件的影響。

1.2.5響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。綜合考慮5個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取影響顯著的pH（A）、酶解時(shí)間（B）和料液比（C）3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以ACE抑制率為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

1.2.6數(shù)據(jù)處理。利用Design-Expert 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果單因素試驗(yàn)獲得青蛤降血壓的制備條件為：溫度55 ℃，時(shí)間8 h，加酶量4 000 U/g，料液比1∶30，pH 6.0，其中pH、酶解時(shí)間和料液比3個(gè)因素對木瓜蛋白酶酶解青蛤制備ACE抑制肽的影響最大。

2.2響應(yīng)面分析結(jié)果對木瓜蛋白酶酶解青蛤制備降血壓肽的試驗(yàn)條件進(jìn)行響應(yīng)面分析，具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 8.0軟件對上述結(jié)果進(jìn)行整理和數(shù)據(jù)分析，選用二次回歸模型進(jìn)行擬合，方差分析結(jié)果見表3。

利用Design-Expert 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到響應(yīng)面法優(yōu)化青蛤降血壓肽的二次多元回歸方程：Y=91.28+5.97A-2.40B+3.17C-3.47AB-0.045AC+598BC-11.19A2-7.03B2-1.91C2。由表3數(shù)據(jù)分析可知，回歸方程因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.863 8），方程的“Prob>F”=0.023 5（<0.05），說明該回歸

方程顯著。失擬項(xiàng)的“Prob>F”=0.000 1（<0.05），說明方

程對試驗(yàn)的擬合度較好，該試驗(yàn)方法可靠。

2.3酶解提取青蛤ACE肽參數(shù)的確定

通過軟件對回歸方程的數(shù)據(jù)分析，得到交互因素相應(yīng)曲面圖及相應(yīng)的等高線（圖1～3）。利用Design-Expert 8.0在設(shè)定因素水平內(nèi)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)分析，得出最佳酶解青蛤制備降血壓肽的試驗(yàn)條件為：pH 5.8、酶解時(shí)間8.4 h、料液比1∶3.1，此時(shí)青蛤ACE肽的ACE抑制率達(dá)93.58%。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，相對誤差小于0.50%，說明建立的回歸方程能夠真實(shí)地體現(xiàn)pH、酶解時(shí)間和料液比3個(gè)因素對青蛤ACE肽酶解提取過程的影響，為青蛤的高效利用提供了理論依據(jù)。

3結(jié)論

青蛤具有很好的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，該研究通過最佳酶篩選、單因素水平確定、響應(yīng)面模型建立、回歸方程分析等試驗(yàn)分析過程，研究了pH、料液比、酶解時(shí)間等因素對青蛤降血壓肽酶解提取過程的影響，得出模型回歸方程：Y=91.28+5.97A-2.40B+3.17C-3.47AB-0.045AC+5.98BC-11.19A2-7.03B2-1.91C2。通過F檢驗(yàn)和方差分

析，證實(shí)該二次模型能夠很好地反映各因素對酶解法提取青蛤降血壓肽過程的影響。

優(yōu)化后的最佳酶解提取青蛤降血壓肽的工藝組合為pH 5.8、酶解時(shí)間8.4 h、料液比1∶3.1，此時(shí)青蛤ACE肽的ACE抑制率達(dá)93.58%，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，相對誤差小于0.50%。

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