白芨種子無菌萌發(fā)及其無性繁殖體系的研究

郄亞微

摘 要 為實現(xiàn)白芨的快速繁殖和工廠化生產(chǎn)，以白芨的成熟蒴果為材料，在MS、1/2MS添加6-BA的培養(yǎng)基上進行無菌播種。將種子萌發(fā)后形成的原球莖接種到不同培養(yǎng)基上進行擴增繁殖，建立白芨無性繁殖體系。結(jié)果表明：種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為培養(yǎng)基1/2MS+6-BA1.0 mg·L-1，它能有效提高萌發(fā)率，促進原球莖的生長；無性繁殖最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1。此體系的建立有助于白芨的相關(guān)研究和產(chǎn)業(yè)化。

關(guān)鍵詞 白芨；種子萌發(fā)；無性繁殖體系

中圖分類號：S567.23 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.29.094

白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]是蘭科白芨屬多年生草本植物，極具經(jīng)濟價值。其塊莖為我國傳統(tǒng)名貴的中藥，有收斂止血、消腫生肌的功能，可治咳血吐血、外傷出血、潰瘍病出血、肺結(jié)核吐血、瘡瘍腫毒等疾病，同時花色艷麗，也是一種觀賞極佳的景觀植物。

白芨分布較廣，在全國大部分省區(qū)均有分布，主產(chǎn)于四川、貴州、湖南、湖北、安徽、江蘇、河南、云南、廣西和浙江等省區(qū)。在野生狀態(tài)下，白芨種子的自然萌發(fā)率極低，繁殖困難，只能依靠人工繁育來提高白芨產(chǎn)量。現(xiàn)在人工繁育的常規(guī)方法以分株為主，即將塊莖分切成小塊種植，但繁殖系數(shù)低、消耗量大，當發(fā)展大面積、規(guī)?；a(chǎn)時，供種困難。另因生境遭受破壞和無序采挖，白芨野生資源嚴重匱乏，已被國家列為珍稀瀕危植物。為滿足市場對白芨藥材的需求，保護野生白芨資源，利用組織培養(yǎng)方法構(gòu)建白芨快速繁殖體系勢在必行。本研究以白芨種子為起點，試圖建立一套經(jīng)濟可靠的白芨組織培養(yǎng)體系，為實現(xiàn)白芨的快速繁殖和工廠化生產(chǎn)提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為成熟未開裂的野生白芨蒴果，采于四川省廣安市廣安區(qū)崇望鄉(xiāng)自力村山谷，地理坐標為東經(jīng)106°38′、北緯30°35′，海拔410 m，中亞熱帶濕潤季風氣候區(qū)，氣候溫暖，熱量充足，雨量豐沛，空氣濕度大，日照少，霜期短，土壤類型為棕壤，pH值為6.7。

試驗材料由廣安新天地農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司高級農(nóng)藝師馬曉彬鑒定。

1.2 方法

1.2.1 無菌播種

選取成熟未裂蒴果，用毛筆輕輕掃去附著在其表面的灰塵，流水洗凈，在超凈臺內(nèi)進行消毒處理，先用75%的醫(yī)用酒精表面消毒30s，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒10 min，無菌水沖洗5～6次，置于無菌濾紙上吸干表面水分。在無菌條件下，用手術(shù)刀縱向剖開蒴果，用鑷子夾取蒴果外殼，將種子均勻播種于培養(yǎng)基。播種后先將培養(yǎng)基置于暗條件下培養(yǎng)，種子萌發(fā)后再移至光照條件下，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照時間10 h·d-1，光照強度1 500～2 000 lx?；九囵B(yǎng)基采用MS、1/2MS的大量元素，每類基本培養(yǎng)基又分別添加6-BA濃度0 mg·L-1、

0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1。所有培養(yǎng)基均添加3%的蔗糖及0.6%的瓊脂，pH值調(diào)至5.8。每個處理接種

5瓶，每瓶種子約為200粒，培養(yǎng)35天后，統(tǒng)計白芨種子的萌發(fā)率。

1.2.2 無性繁殖體系構(gòu)建

種子萌發(fā)形成原球莖后，將原球莖轉(zhuǎn)接到無性繁殖培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同激素6-BA和NAA的組合配比，6-BA濃度設置三水平（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1），NAA濃度設置三水平（0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1），完全隨機設計共9個處理，添加3%蔗糖及0.6%的瓊脂，pH值調(diào)至5.8。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照時間10 h·d-1，

光照強度1 500～2 000 lx。每個處理接種10瓶，培養(yǎng)35天后，觀察原球莖的生長狀況和調(diào)查原球莖繼代增殖

數(shù)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 白芨種子無菌萌發(fā)

黑暗培養(yǎng)10天后，在培養(yǎng)基中可觀察到有少數(shù)種胚膨大，繼而突破種皮開始萌發(fā)；轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)后，種子開始顏色變綠，并有原球莖發(fā)育。白芨種子呈粉末狀，解剖鏡下觀察，種子呈紡錘形，結(jié)構(gòu)簡單，由一層透明的種皮和1個種胚組成。白芨種子在自然條件下發(fā)芽率很低，影響其萌發(fā)的因素很多，有種皮的機械阻力和透水性差、種胚發(fā)育不全、貯存的營養(yǎng)物質(zhì)過少以及可能存在抑制物質(zhì)等。

2.2 基本培養(yǎng)基對白芨種子萌發(fā)的影響

接種10天后，兩種基本培養(yǎng)基中的種子均有萌發(fā)。由表1可知，各處理中種子的萌發(fā)率以1/2MS培養(yǎng)基最佳。方差分析表明，培養(yǎng)基對種子萌發(fā)率的影響及其顯著，采用1/2MS培養(yǎng)基，平均萌發(fā)率為74.73%，顯著高于MS培養(yǎng)基，這也說明成熟種子的胚自身貯藏的營養(yǎng)可以滿足種子萌發(fā)的需求。從種子萌發(fā)后幼苗生長情況看，1/2MS培養(yǎng)基處理后幼苗生長在整齊程度、高度、顏色等方面略優(yōu)于MS培養(yǎng)基處理。

2.3 6-BA濃度對白芨種子萌發(fā)率的影響

由表1可知，處理7的種子萌發(fā)率最高，高達89.2%，且萌發(fā)后幼苗芽整齊，較粗壯，高約0.8 cm，顏色濃綠，部分有根毛長出。當6-BA濃度分別為0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、

1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1時，平均萌發(fā)率為58.15%、67.50%、79.45%、64.25%。通過多重比較，采用6-BA濃度1.0 mg·L-1時顯著高于其他濃度水平，其他濃度水平之間差異不顯著。故6-BA濃度為1.0 mg·L-1時，即為白芨種子萌發(fā)的最適濃度。

2.4 不同激素處理對白芨繼代培養(yǎng)的影響

將原球莖轉(zhuǎn)入擴繁培養(yǎng)基培養(yǎng)35天后，不同培養(yǎng)基中原球莖的增殖率及原球莖繼代增殖倍數(shù)見表2。在培養(yǎng)基處理D中，原球莖增殖率達81.2%，增殖倍數(shù)達到3.7，為最高增殖倍數(shù)，且觀察到原球莖顆粒飽滿、狀態(tài)良好，呈濃綠色，無分化現(xiàn)象，優(yōu)于其他處理組合。即可篩選出MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1為最佳擴增繁殖培養(yǎng)基。實驗中也發(fā)現(xiàn)原球莖增殖率較小的激素組合，原球莖會萌發(fā)形成幼苗。因此，在擴繁培養(yǎng)中，如將激素組合設定為6-BA1.0 mg·L-1+NAA

0.1 mg·L-1，可大量擴增原球莖；如將激素組合調(diào)整為6-BA1.0 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1，則利于植株生長，可獲得白芨幼苗。

3 小結(jié)與討論

1）選用大量元素減半的1/2MS培養(yǎng)基作為種子萌發(fā)的基本培養(yǎng)基，其鹽分較低，有利于萌發(fā)，白芨種子的萌發(fā)率均達51.6%以上，最高可達79.2%。少數(shù)種子未能萌發(fā)的原因可能是在培養(yǎng)基中吸水分不足或胚的結(jié)構(gòu)不完整。張建霞等[1]發(fā)現(xiàn)，白芨種子的有胚率與蒴果的胚齡有關(guān)，胚齡越長，有胚率越高。本試驗所用的材料采集于野外，白芨蒴果已經(jīng)成熟但未開裂，故有胚率較高，萌發(fā)率較高。

2）在無菌播種試驗中，培養(yǎng)基均添加了單一激素6-BA，并設計了濃度梯度0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、

1.5 mg·L-1，結(jié)果表明：6-BA濃度為1.0 mg·L-1時種子萌發(fā)率最高，這與袁寧[2]、王楷[3]等的結(jié)果相似。此外，添加活性炭可以為培養(yǎng)提供暗環(huán)境，更有易于種子萌發(fā)及幼苗生長，添加濃度以0.1%為宜。

3）不同植物激素濃度及配比與原球莖的增殖有很大關(guān)系，原球莖的繼代增殖需要濃度適宜的植物生長素和細胞分裂素共同作用。在原球莖擴增繁殖試驗中，設計三個濃度（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1）的6-BA和三個濃度（0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1）的NAA進行組合配比，經(jīng)過試驗選出最適宜原球莖繁殖的培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1。本試驗結(jié)果中處理F：6-BA濃度為1.0 mg·L-1、NAA濃度為1.0 mg·L-1利于植株生長，可獲得幼苗，為理想的生長培養(yǎng)基。

參考文獻：

[1] 張建霞，付志惠，李洪林，等.白芨胚發(fā)育與種子萌發(fā)的關(guān)系[J].亞熱帶植物科學，2005，34（4）：32-35.

[2] 袁寧.白芨組織培養(yǎng)技術(shù)體系研究[D].成都：西南交通大學，2008.

[3] 王楷，李玥，張云峰，等.白芨種子高效萌發(fā)及其無性繁殖體系的構(gòu)建[J].云南農(nóng)業(yè)大學報，2006，21（2）：160-163.

（責任編輯：劉昀）