豬流行性腹瀉病毒血清學(xué)及臨床診斷方法研究進展

雷喜梅，楊永樂，許姝雅，趙鵬偉，王斌，黃耀偉

（浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，杭州310058）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是冠狀病毒科甲型冠狀病毒屬成員之一[1]。全日齡的豬均可感染PEDV，其中：哺乳仔豬會出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐、脫水及較高的致死率，而較大日齡豬感染后臨床癥狀較溫和，死亡率較低[2-3]。1978年，PEDV在歐洲首次被發(fā)現(xiàn)并確定為豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）的致病因子[4]。1984年，我國確定存在PEDV。在1984—2010年間我國豬場雖存在PEDV感染，但并未發(fā)生大規(guī)模疫情[5]。自2010年末起，PED在南方幾個養(yǎng)豬大省出現(xiàn)，隨后全面爆發(fā)，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[6]。

哺乳仔豬出現(xiàn)水樣腹瀉和高致死率是PEDV感染的最主要特點；但其他豬腸道冠狀病毒，包括豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、豬丁型冠狀病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）及新發(fā)現(xiàn)的豬腸道甲型冠狀病毒（swine enteric alphacoronavirus,SeACoV）也會引起相似的臨床癥狀[7-9]。因此，對臨床感染PEDV的準(zhǔn)確診斷需要對PEDV特異性核酸或蛋白質(zhì)進行檢測，而不能僅依據(jù)臨床癥狀和腸道病理變化。

傳統(tǒng)的PEDV診斷方法主要依靠對病毒核酸、蛋白質(zhì)或病毒特異性抗體進行檢測。相比之下，雖然病毒學(xué)及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）檢測方法已能對PEDV感染作出準(zhǔn)確診斷，但血清學(xué)方法可以對群體的免疫狀態(tài)進行監(jiān)測，從而為PED的防控提供更有價值的信息。

新生仔豬主要通過感染或免疫母豬的乳汁獲得PEDV保護性抗體[10]。而乳液免疫主要依賴于腸道PEDV特異性IgA漿細胞遷移至乳腺，以及分泌性IgA（sIgA）在乳汁中的匯聚[11]。因此，對免疫后群體的抗體水平，尤其是母豬體內(nèi)的抗體（病毒特異性IgG和IgA）水平，以及中和抗體水平進行監(jiān)測至關(guān)重要。

本文對PEDV的血清學(xué)及診斷方法進行了綜述，總結(jié)討論了感染后抗體的動態(tài)，以期為PEDV快速檢測方法的建立提供思路，為監(jiān)測及評估群體免疫水平、優(yōu)化防控策略提供參考。

1 PEDV編碼蛋白及其功能

PEDV基因組含7個開放閱讀框（ORF1a、ORF1b和ORF2～6）。其中，ORF1a和1b編碼2個大的多聚蛋白（pp1a和pp1b），隨后被病毒自身編碼的蛋白酶切割成16個非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp1～16），參與病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[12-13]。ORF2～6編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白，包括纖突糖蛋白（S蛋白）、膜蛋白（M蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）和核蛋白（N蛋白）以及1個附屬蛋白ORF3[12-14]。其中，S蛋白主要介導(dǎo)病毒與受體結(jié)合、細胞融合和病毒入侵，是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗PEDV中和抗體的主要靶標(biāo)抗原[10]。因此，S蛋白常作為PEDV流行病學(xué)研究、分子診斷和血清學(xué)診斷的靶標(biāo)抗原[15-16]；結(jié)構(gòu)蛋白M和N也常用于PEDV分子診斷和血清學(xué)診斷試驗[17]。

PEDV的S蛋白屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，由大約1 383個氨基酸組成（不同毒株有個別氨基酸插入或缺失），包括1個信號肽（1～18 aa）、一些中和抗原表位（499～638、748～755、764～771、1 368～1 374 aa）、1個跨膜區(qū)域和1個較短的細胞質(zhì)區(qū)域[18]。根據(jù)冠狀病毒S蛋白同源性可將PEDV的S蛋白劃分為S1（1～789 aa）和S2（790～1 383 aa）2個亞單位[12]。對甲型和乙型冠狀病毒S蛋白的電鏡觀察表明：S1蛋白作為受體結(jié)合單位有多個抗原表位區(qū)域[19-20]，其中包括4個主要的核心表位區(qū)域（S1A、S1B、S1C和S1D）；許多冠狀病毒包括PEDV的S1蛋白N端還有1個S10區(qū)域。S1B區(qū)域是大多數(shù)冠狀病毒受體結(jié)合域[19-20]。研究表明，PEDV S1B區(qū)域與氨基肽酶N（aminopeptidase N，APN）相互作用，利用APN作為其功能性受體[21-22]；但隨后有報道對該結(jié)論表示質(zhì)疑[23]。因此，APN是否為PEDV的功能性受體還有待進一步研究。

冠狀病毒不僅與蛋白受體結(jié)合，而且與唾液酸類糖蛋白結(jié)合[24]。對于甲型冠狀病毒TGEV，其唾液酸結(jié)合活性在S10區(qū)域。一些PEDV毒株的S1蛋白也有唾液酸結(jié)合活性和血凝活性，且主要定位在PEDV S10區(qū)域第246位氨基酸（246 aa）處[25]。不同PEDV毒株的S10區(qū)域有很大程度的遺傳變異，包括區(qū)分S缺失株和非缺失株的插入和缺失[26-27]。S10區(qū)域的變異也可能是不同PEDV毒株之間唾液酸結(jié)合活性差異的原因。

病毒的受體結(jié)合區(qū)域通常是潛在的中和表位。研究表明，很多冠狀病毒S1區(qū)域的中和抗體表位與受體結(jié)合區(qū)域重合[28]。針對PEDV的S1蛋白（499～638 aa）區(qū)域產(chǎn)生的多抗有一定的中和活性[29]。據(jù)報道，一個具有中和活性的抗PEDV單抗，其表位定位在PEDV的S蛋白390～789 aa處[30]。而在S1與S2結(jié)合處，鑒定出2個非中和性抗原表位[31]。LI等[11]鑒定出位于PEDV的S1亞單位上的6個無重疊的中和性和非中和性抗原表位，并證實中和性抗原表位可能主要定位在唾液酸結(jié)合區(qū)域（S10）或受體結(jié)合區(qū)域（S1B），進一步闡明了病毒表面細胞結(jié)合區(qū)域可能是潛在的中和區(qū)域。

PEDV的M蛋白作為一個跨膜結(jié)構(gòu)糖蛋白，在病毒組裝過程和補體依賴的病毒中和作用中發(fā)揮重要作用[32]。M蛋白和E蛋白共表達可以組裝成假病毒顆粒，且該粒子與全病毒顆粒的抗原性基本一樣[33]。鑒于M蛋白具有3次跨膜結(jié)構(gòu)，對于其完整結(jié)構(gòu)的研究較少。

PEDV的N蛋白與病毒RNA結(jié)合，為核衣殼形成提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是與病毒基因組相關(guān)的最基本的磷酸化蛋白[34]。因此，N蛋白可以作為PEDV感染早期診斷的靶標(biāo)。但N蛋白在不同豬腸道冠狀病毒中相對保守，存在抗原交叉反應(yīng)[35]，所以基于該蛋白的檢測不能有效區(qū)分PEDV和其他豬腸道冠狀病毒。

E蛋白作為冠狀病毒小包膜糖蛋白，在不同冠狀病毒中的功能有很大差異，且在病毒粒子的組裝、病毒遷移、離子通道功能以及基因組表達方式等方面發(fā)揮的作用也都不盡相同[36-37]。當(dāng)前基于PEDV E蛋白的血清學(xué)檢測方法鮮有報道。

ORF3蛋白作為PEDV的唯一附屬蛋白，可能對病毒毒力、細胞適應(yīng)性等有影響[38]。高度細胞適應(yīng)株與流行株之間ORF3的基因差異可以作為區(qū)分不同PEDV毒株的靶標(biāo)[39]，但能否作為臨床免疫應(yīng)答檢測指標(biāo)尚屬未知。

在PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein,NSP）中，NSP3由多個結(jié)構(gòu)域組成，包括N端的酸性區(qū)域（acidic domain,Ac）和1個高度保守的ADRP（ADP-ribose-1-phosphatase）多功能區(qū)域。Ac可能在病毒組裝以及感染早期與核衣殼相互作用過程中發(fā)揮作用。ADRP則為冠狀病毒基因組和亞基因組RNA的合成提供必要的輔助作用[40]。整體而言，當(dāng)前對PEDV、PDCoV、TGEV等豬腸道冠狀病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，如NSP1、NSP2等的研究主要集中在免疫調(diào)控方面[41-43]，尚未對其血清學(xué)反應(yīng)進行系統(tǒng)分析。

2 PEDV感染的宿主體液免疫應(yīng)答

PEDV主要通過糞口途徑傳播，感染后6～14 d可在血清中檢測到抗PEDV的特異性抗體[17]。THOMAS等[44]研究表明，抗PEDV的N蛋白和S蛋白的抗體反應(yīng)并不相同：PEDV N蛋白特異性IgM在感染后7 d達到峰值，而S蛋白特異性IgM峰值出現(xiàn)在感染后14 d，此后一直下降至21 d；對于N、S蛋白特異性IgG，檢出起點均為感染后7 d，前者的檢測峰值為21 d，后者為14 d，兩者均在感染后21 d開始下降，但N蛋白IgG一直維持到感染后43 d；對于N、S蛋白特異性IgA，S蛋白IgA消長動態(tài)與其IgG變化趨勢類似，即在感染后7 d檢出水平較低，14 d達到峰值，隨后一直維持至感染后6個月。

總體而言：在感染豬血清中，對于IgM抗體，N蛋白先于S蛋白出現(xiàn)；特異性IgG出現(xiàn)時間相同，但S蛋白抗體更早到達峰值，維持時間較短；特異性IgA動態(tài)變化趨勢與IgG相似。這表明，可以根據(jù)不同臨床檢測目的選擇N蛋白或S蛋白作為PEDV感染不同階段的診斷抗原。

CLEMENT等[45]對口腔分泌物中PEDV特異性IgG和IgA的檢測表明：IgA占主要成分，且一直持續(xù)增長至感染后100 d；相比之下，IgG在14 d達到峰值，隨后逐漸下降。PEDV中和性抗體（NAbs）在感染后7～14 d開始檢出，在21 d達到峰值[44-46]。此外，NAbs能在感染后維持至少6個月[44-47]，與口腔分泌物中IgA的檢測趨勢相似，這可為PEDV感染后檢測樣品的選擇提供重要參考。

3 PEDV特異性抗體的血清學(xué)診斷方法

PEDV主要在小腸中感染及復(fù)制，可出現(xiàn)短暫的病毒血癥[48]。因其主要威脅新生仔豬，故PED的防控主要集中在如何提高新生仔豬黏膜免疫力，以及如何提高母乳中保護性抗體水平上。研究表明，母乳中PEDV的IgA水平與仔豬糞便中病毒RNA的排毒量呈線性關(guān)系，母乳中IgA水平高，則仔豬糞便排毒量顯著下降[49]，證明IgA在乳液免疫和被動保護中發(fā)揮重要作用，同時也表明系統(tǒng)性抗體有助于仔豬抗PEDV感染。因此，對母豬乳汁和血清中抗體的檢測均有助于對仔豬有效保護力的評估。

目前，血清學(xué)試驗已成為評估PEDV感染后宿主抗體反應(yīng)、群體免疫狀態(tài)、疫苗及免疫策略有效性的重要方法。間接免疫熒光試驗（indirect fluorescent antibody,IFA）、病毒中和試驗（virus neutralization,VN）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）及熒光微珠免疫試驗（fluorescent microsphere immunoassay,FMIA）均可用于感染動物的血清、初乳、乳汁、糞便及口腔分泌物中PEDV抗體的檢測[16-17,50-51]。

3.1 間接免疫熒光試驗

間接免疫熒光試驗（IFA）常用來檢測PEDV抗體，評估感染畜群的免疫狀態(tài)[46-52]。通常將PEDV感染的Vero細胞培養(yǎng)物作為抗原對血清抗體進行檢測。如果是陽性樣本，則PEDV特異性抗體與固定在固相物上的抗原相結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的抗豬二抗放大信號，以倒置熒光顯微鏡進行觀察。相比ELISA和熒光聚點中和試驗（fluorescent focus neutralization,FFN），IFA費時少，易操作。

IFA也可用于PEDV特異性抗體的定量檢測。測定抗體滴度時，將PEDV感染的細胞和連續(xù)倍比稀釋的血清共同孵育，然后由特異性熒光信號所在的血清稀釋度判定抗體效價。雖然IFA可作為急性感染階段檢測PEDV抗體的重要方法，但其敏感度較低，并不適合作為PEDV感染狀況監(jiān)測的最佳方法[46-52]。與ELISA方法相比，IFA終點滴度判讀的主觀性較大，容易出現(xiàn)人工誤差。

3.2 病毒中和試驗

病毒中和試驗是通過中和抗體（NAbs）與病毒粒子的結(jié)合阻遏病毒復(fù)制周期中的一個或多個步驟，以降低病毒感染力為判定標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法[53]。如今已普遍用于PEDV特異性抗體的檢測。

PAUDEL等[52-53]以致細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect,CPE）為依據(jù)檢測了PEDV中和性單抗的中和效果。如病變不明顯，則采用FFN來檢測抗體[17,46]。其具體方法為：將連續(xù)稀釋的血清和固定數(shù)量的PEDV抗原混合，孵育后感染Vero細胞，再用熒光標(biāo)記的PEDV抗體來測定PEDV的感染力；以陰性對照為基準(zhǔn)，將引起90%以上熒光消失的最高血清稀釋度判定為中和滴度。由于在感染細胞中能更早檢測到PEDV抗原，因此，以FFN檢測中和抗體速度較快。

OKDA等[17]和JUNG等[46]利用FFN檢測了PEDV試驗感染后7～14 d的血清中和抗體，THOMAS等[44]和POONSUK等[47]用相似方法檢測了自然感染6個月后的血清中和抗體，發(fā)現(xiàn)分娩4 d后母豬初乳中和抗體水平高于血清[17,46]。COLLIN等[54]、LIU等[55]、CHEN等[56]和LIN等[57]均基于VN或FFN對PEDV新型疫苗候選株進行了評估。由于中和抗體具有較高的專一性，SUN等[35]和GIMENEZLIROLA等[58]用VN區(qū)分了PEDV和TGEV誘導(dǎo)的抗體。經(jīng)過優(yōu)化的FFN試驗可用于初乳和乳汁中PEDV中和抗體的定性或定量檢測，是監(jiān)測母豬乳汁中母源抗體的重要工具，但其主要不足仍在于中和抗體滴度終點判讀的主觀差異。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

當(dāng)前用于檢測PEDV抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）主要包括間接法和競爭法2種。間接ELISA使用的抗原主要是全病毒或原核表達的重組病毒蛋白（S蛋白、N蛋白和M截短蛋白[59]）。競爭ELISA主要使用PEDV特異性單抗或多抗，其主要優(yōu)勢在于特異性，但不足之處是其主要依賴于競爭抗體的獨特型及其針對靶抗原的特異性[59]。OKDA等[17]建立了幾種檢測PEDV抗體的血清學(xué)方法，包括基于PEDV的N蛋白間接ELISA和競爭ELISA。經(jīng)試驗和臨床驗證，該方法的敏感性和特異性均超過97%。2種ELISA方法都可檢測感染后9～14 d的N蛋白特異性IgG，感染后43 d仍可捕獲到較低水平的信號，足見其敏感性較強。POONSUK等[47]和LIN等[60]建立了可以評估口腔分泌物中PEDV特異性IgG和IgA的間接ELISA方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)口腔分泌物中特異性IgA持續(xù)增長至感染后100 d，表明采集口腔分泌物能較好地監(jiān)測PEDV的感染狀況。

3.4 熒光微珠免疫試驗

熒光微珠免疫試驗（FMIA）是將特定病毒抗原與免疫微珠結(jié)合，然后利用生物素-鏈親和素?zé)晒庀到y(tǒng)檢測特異性抗體，再利用雙重掃描設(shè)備以熒光強度指數(shù)判定結(jié)果。相比ELISA和FMIA，依據(jù)流式熒光微珠掃描系統(tǒng)能獲得更高的分析敏感度、檢測速率及通量。此外，還能對不同抗原產(chǎn)生的抗體進行檢測。

OKDA等[17]建立了以PEDV的N蛋白為抗原的FMIA方法，用以檢測血清中PEDV特異性抗體。該研究使用大量試驗感染和臨床感染樣本，在感染后6 d及43 d均能檢測到N蛋白的特異性抗體，其結(jié)果與間接ELISA、競爭ELISA及IFA結(jié)果有很高的相關(guān)性，敏感性和特異性均超過98%。雖然該試驗僅采用N蛋白作為抗原，檢測結(jié)果不太全面，但仍表明FMIA可作為未來血清學(xué)檢測的重要工具。

3.5 不同PEDV血清學(xué)診斷方法小結(jié)

PEDV感染后的快速診斷是防控PED的有效措施，血清學(xué)檢測是監(jiān)測PEDV感染狀況和評估疫苗接種有效性的有力工具。自2013年P(guān)ED在美國爆發(fā)以來，針對PEDV的血清學(xué)診斷方法大量涌現(xiàn)，以期對PEDV不同毒株包括經(jīng)典毒株、流行毒株及S缺失毒株的抗體進行鑒別診斷。特異性工具如PEDV結(jié)構(gòu)蛋白S、N和M單抗，尤其是抗S1蛋白中和性單抗的研發(fā)[30]，必將有助于這些診斷方法的應(yīng)用與完善。

基于本實驗室制備得到的S蛋白特異性單抗、多抗及原核或真核表達的結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白，筆者也正通過反向遺傳學(xué)構(gòu)建的表達綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白的重組PEDV病毒，逐步建立與完善可以有效鑒別與診斷PEDV經(jīng)典毒株和流行毒株的檢測方法。

4 小結(jié)與展望

PED在2010年后的爆發(fā)與PEDV變異株的出現(xiàn)有關(guān)[61]。雖然PEDV包膜蛋白M和核衣殼蛋白N也常用作血清學(xué)診斷的靶蛋白[17,62-63]，但其基因相對保守，不能準(zhǔn)確反映PEDV流行株的臨床感染情況。GIMENEZ-LIROLA等[58]分別用PEDV全病毒及重組蛋白S、M、N和E蛋白作為抗原對臨床感染豬的792份血清樣品中PEDV特異性抗體進行了ELISA檢測，結(jié)果表明，以S1蛋白為抗原可以更好地反映臨床感染后抗體動態(tài)規(guī)律。這與PEDV的變異及S基因重組相關(guān)的研究結(jié)果一致[60]。因此，當(dāng)前亟須用更加準(zhǔn)確、快速的診斷方法對PEDV的S基因變異情況加以監(jiān)測。

PEDV的免疫監(jiān)測困難，加上國內(nèi)有效免疫監(jiān)測方法的缺失，導(dǎo)致了疫苗接種與免疫監(jiān)測的嚴(yán)重脫鉤。當(dāng)前商品化ELISA試劑盒的效果不佳，在實際生產(chǎn)中很難應(yīng)用[63]。因此，有效疫苗與診斷試劑盒的研發(fā)是當(dāng)前防控PED的重點之一。

新生仔豬對PEDV的免疫抗性主要由母源抗體提供，具有保護力的sIgA、IgG和IgM通過初乳和乳汁傳給新生仔豬[64]。初乳中的IgG、sIgA主要由乳腺中抗體分泌細胞產(chǎn)生[9]。LANGEL等[9]對腸道-乳腺-sIgA抗體分泌軸進行了詳細總結(jié)，結(jié)果表明，口服接種可以更有效地激活黏膜免疫系統(tǒng)，在黏膜和血液中產(chǎn)生保護性IgA，從而提高母豬和仔豬的免疫水平。基于這一原理，HOU等[65]于2007年通過試驗發(fā)現(xiàn)，使用乳酸桿菌表達PEDV的N蛋白可針對性地刺激黏膜IgA和IgG產(chǎn)生。隨后，LIN等[57]于2015年構(gòu)建了可同時表達S1蛋白和N蛋白的重組乳酸桿菌疫苗，并證實該疫苗可誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，MENG等[66]利用真核表達載體構(gòu)建了表達PEDV S蛋白的DNA疫苗，并證實該疫苗能有效激活細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及誘導(dǎo)高水平抗體產(chǎn)生。2017年，HUANG等[67]構(gòu)建了表達S基因的樹突狀細胞靶向性乳酸菌疫苗，經(jīng)口服免疫小鼠后，可在其體內(nèi)檢測到高水平的PEDV IgG和sIgA，證明了該疫苗在小鼠動物模型中的有效性。

大力投入疫苗研發(fā)勢必可為PED的防控提供有力的工具，但當(dāng)前仍然缺乏評價這些基因工程疫苗免疫效力的動物模型，因此對免疫豬，尤其是母豬抗體動態(tài)的研究十分匱乏。此外，PEDV感染或免疫后保護性抗體與中和抗體、特異性sIgA、IgG之間的關(guān)系也尚缺乏翔實可信的研究報道。

最后，PEDV病毒的變異性，以及與多種腸道病毒的混合感染等變量因子導(dǎo)致PEDV感染的監(jiān)測和防控更為困難。未來防控工作應(yīng)主要著眼于PEDV流行株變異情況的跟進檢測，以及對免疫動物應(yīng)答水平動態(tài)變化的持續(xù)監(jiān)控。

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