化妝品菌落總數(shù)計(jì)數(shù)檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果與分析

劉恩思 張麗娜 劉美秀 蔣玲

[摘要] 為提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室競(jìng)爭(zhēng)力。2017年參加中國(guó)食品藥品檢定研究院組織的化妝品中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)檢測(cè)能力驗(yàn)證（NIFDC-PT-126）。依據(jù)檢測(cè)能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版），對(duì)樣品進(jìn)行化妝品中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)檢測(cè)，高濃度樣品結(jié)果不滿意，低濃度樣品結(jié)果滿意。對(duì)這次能力驗(yàn)證過程進(jìn)行分析和總結(jié)，希望可以規(guī)范實(shí)驗(yàn)室以后的能力驗(yàn)證活動(dòng)。

[關(guān)鍵詞] 能力驗(yàn)證；菌落總數(shù)計(jì)數(shù)；化妝品

[中圖分類號(hào)] R446 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-5654（2018）07（b）-0147-02

能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力[1]。實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)是按照預(yù)先規(guī)定的條件，由兩個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)相同或類似的物品進(jìn)行測(cè)量或檢測(cè)的組織、實(shí)施和評(píng)價(jià)[1]。實(shí)驗(yàn)室可以通過參加并利用能力驗(yàn)證這種外部質(zhì)量保證工具，識(shí)別與其他實(shí)驗(yàn)室之間的差異，監(jiān)督和改進(jìn)自身檢測(cè)能力，對(duì)所用方法及儀器進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)部質(zhì)控，為自身的持續(xù)改進(jìn)和完善質(zhì)量管理體系提供信息。2017年該實(shí)驗(yàn)室參加由中國(guó)食品藥品檢定研究院組織和實(shí)施的化妝品菌落總數(shù)計(jì)數(shù)檢測(cè)能力驗(yàn)證，高濃度樣品結(jié)果不滿意，低濃度樣品結(jié)果滿意。這是該實(shí)驗(yàn)室首次參加微生物檢測(cè)項(xiàng)目的能力驗(yàn)證，對(duì)這次能力驗(yàn)證過程進(jìn)行分析和總結(jié)，希望可以規(guī)范該實(shí)驗(yàn)室以后的能力驗(yàn)證活動(dòng)。

1 資料與方法

1.1 材料

能力驗(yàn)證樣品來(lái)自NIFDC-PT-126化妝品菌落總數(shù)計(jì)數(shù)檢測(cè)，共2份樣品，代碼分別為0117、0120，每份樣品為西林瓶裝的白色菌球及膏狀粉底，1 g/瓶，樣品保藏溫度為-20℃，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2 儀器與試劑

SPX-150型生化培養(yǎng)箱、LT502型電子天平、LMQ.C型立式滅菌器 、GD65-1型鼓風(fēng)干燥箱、一次性使用培養(yǎng)皿（生產(chǎn)日期2017.10.29，滅菌有效期2年）、卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)： 20170925）。

1.3 方法

按照NIFDC-PT-126化妝品中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)檢驗(yàn)作業(yè)指導(dǎo)書和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）[1]的要求進(jìn)行樣品稀釋、注皿、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

1.3.1 稀釋樣品 獲得樣品后，待其恢復(fù)至室溫，再開啟西林瓶。分別在每個(gè)西林瓶中加入5 mL 滅菌生理鹽水，將樣品完全溶解并充分混勻，轉(zhuǎn)移到滅菌的刻度試管中，然后在用滅菌生理鹽水洗西林瓶3次，1 mL/次，最后定容至10 mL，制成1：10的稀釋液檢液。用移液器吸取1：10的稀釋液1 mL沿管壁注入盛有9 mL滅菌生理鹽水的無(wú)菌試管中，渦旋振蕩使其充分混勻，作為1：100的稀釋液；按上述操作方法制備10-3至10-10稀釋液。操作各環(huán)節(jié)應(yīng)保證無(wú)菌和充分混勻。

1.3.2 測(cè)定菌落總數(shù) 卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基水浴保溫，保證溫度大約為45℃。從2.1中制備的1∶10 至10-10稀釋液中，每個(gè)稀釋度分別各取出1 mL加入到2個(gè)無(wú)菌平皿中，每皿加入約15 mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待培養(yǎng)基凝固后倒置放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)溫度為36℃。 培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)1次，48 h后再次計(jì)數(shù)。同時(shí)以培養(yǎng)基做空白對(duì)照。

2 結(jié)果

取2個(gè)平皿讀數(shù)的平均值作為最終結(jié)果。樣品0171，計(jì)數(shù)結(jié)果為130 000 CFU/g。樣品0120，計(jì)數(shù)結(jié)果為170 000 CFU/g。見表1。

3 分析與討論

NIFDC-PT-126化妝品菌落總數(shù)計(jì)數(shù)檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃為定量檢測(cè)項(xiàng)目，設(shè)計(jì)了2個(gè)不同濃度的樣品，有一定難度。該實(shí)驗(yàn)室高濃度樣品結(jié)果不滿意，低濃度樣品結(jié)果滿意，且兩項(xiàng)結(jié)果均低于指定值。初步分析原因可能是：①防腐劑未全部中和?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）[2]規(guī)定化妝品中可以添加防腐劑來(lái)抑制微生物的生長(zhǎng)，允許使用的化妝品防腐劑達(dá)到51種；同時(shí)在菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法中規(guī)定在培養(yǎng)基中加入卵磷脂和吐溫80來(lái)中和化妝品中的防腐劑。但是實(shí)驗(yàn)中防腐劑和其他抑菌成分是否被有效中和沒有相應(yīng)的判定方法。②樣品溶液過于濃稠，稀釋后的樣品可能未完全溶解或混勻不充分。根據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn)，樣品過于濃稠和菌落總數(shù)結(jié)果太高時(shí)，采用培養(yǎng)基稀釋法利于菌落的生長(zhǎng)和計(jì)數(shù)，可以獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果。③該次實(shí)驗(yàn)方案有疏漏之處，沒有設(shè)計(jì)人員比對(duì)和稀釋液（滅菌生理鹽水）對(duì)照，無(wú)法排除人員操作和稀釋液對(duì)結(jié)果的影響。

實(shí)驗(yàn)過程中有幾個(gè)操作要點(diǎn)需要注意：①樣品要全部使用完，稀釋度至少做到10-10，確保有適宜計(jì)數(shù)的平板。②在培養(yǎng)皿中加入樣品溶液后，盡快倒入45℃的培養(yǎng)基，并混勻。防止培養(yǎng)皿吸附細(xì)菌并成片生長(zhǎng)無(wú)法計(jì)數(shù)。③平板培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)一次，防止菌落蔓延，培養(yǎng)48 h無(wú)法計(jì)數(shù)。④TTC也是一種抑菌劑，會(huì)抑制部分細(xì)菌生長(zhǎng)，由于此次項(xiàng)目為菌落計(jì)數(shù)，且經(jīng)渦旋振蕩處理的檢液中幾乎無(wú)顆粒，在實(shí)驗(yàn)時(shí)未加入TTC。但由于缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，這樣操作可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，在今后的實(shí)驗(yàn)中考慮用加了TTC的對(duì)照組來(lái)比較計(jì)數(shù)結(jié)果，再綜合判定選擇以哪個(gè)計(jì)數(shù)結(jié)果報(bào)告。⑤為了盡量減少人員操作對(duì)結(jié)果的影響，除樣品稀釋外，全過程可以設(shè)計(jì)雙人同時(shí)實(shí)驗(yàn)。也可以在實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)置觀察員，監(jiān)督實(shí)驗(yàn)操作。雙人實(shí)驗(yàn)時(shí)要統(tǒng)一菌落計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)，避免人為誤差。對(duì)于同一平板，兩人計(jì)數(shù)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)時(shí)，可以判斷為結(jié)果一致。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版[2]中的微生物檢驗(yàn)方法均未明確要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，但結(jié)合以往的藥品微生物檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，如果不能有效去除樣品中的抑菌成分，會(huì)造成菌落計(jì)數(shù)結(jié)果偏低，致病菌檢測(cè)“假陰性”結(jié)果?？梢詤⒄铡斗菬o(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查微生物計(jì)數(shù)法》《非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查控制菌檢查法》[3]進(jìn)行方法學(xué)研究，選擇適宜的敏感菌株，采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法及薄膜過濾法等不同的樣品處理方法，有效去除化妝品中防腐劑和其他抑菌成分的影響。測(cè)定敏感菌株的回收率達(dá)到50%以上，認(rèn)為供試液制備方法、抑菌成分的消除方法經(jīng)上述方法學(xué)驗(yàn)證可以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，提高實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果檢出率[4]。對(duì)于抑菌作用較強(qiáng)的供試品，在供試品溶液性狀允許的情況下，應(yīng)盡量選用薄膜過濾法進(jìn)行試驗(yàn)。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）[2]中的微生物檢驗(yàn)方法沒有規(guī)定對(duì)實(shí)驗(yàn)材料（培養(yǎng)基和試劑）的質(zhì)量要求?？梢詤⒄铡斗菬o(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查微生物計(jì)數(shù)法》《非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查控制菌檢查法》[3]和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》[5]對(duì)使用的培養(yǎng)基進(jìn)行適用性和靈敏性檢查，確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果較準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)材料品牌和批號(hào)用于能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)使用。

能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)前應(yīng)該多做幾次預(yù)實(shí)驗(yàn)，特別是采購(gòu)質(zhì)控樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，用以驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)室使用的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)材料，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。在方法學(xué)驗(yàn)證資料和預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，建立該項(xiàng)目的能力驗(yàn)證SOP，確保能力驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)方案科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，得到準(zhǔn)確和滿意的結(jié)果。

希望該實(shí)驗(yàn)室通過各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的累積，逐步建立各檢驗(yàn)項(xiàng)目的能力驗(yàn)證SOP；通過不斷參加能力驗(yàn)證活動(dòng)，持續(xù)提升自身的技術(shù)能力。

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（收稿日期：2018-04-15）