小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體的制備與再生

沈慧敏 李超 高利 劉太國 劉博 陳萬權(quán)

摘要 本文優(yōu)化了小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體的制備與再生條件。結(jié)果表明：小麥矮腥黑粉菌的冬孢子在土壤浸提液固體培養(yǎng)基中萌發(fā)后轉(zhuǎn)接入T19液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)45 d，以菌絲作為酶解初始材料，用1.5%崩潰酶+1.5%溶壁酶+1.5%蝸牛酶復(fù)合酶液28℃酶解2.5 h原生質(zhì)體的獲得率最高；以1.2 mol/L的氯化鉀為滲透壓穩(wěn)定劑，所得原生質(zhì)體數(shù)量最多，且釋放的原生質(zhì)體能均勻分散分布，不聚集成堆；小麥矮腥黑粉菌的原生質(zhì)體在TB3培養(yǎng)基上能長出較多的單菌落。

關(guān)鍵詞 小麥矮腥黑粉菌； 原生質(zhì)體； 制備； 再生

中圖分類號： S 435.121

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017239

Abstract Protoplast is the receptor cells for genetic transformation of fungi. To establish protoplast-mediated genetic transformation system of Tilletia controversa， conditions for the protoplast isolation and regeneration of T.controversa were optimized， including incubation time， various enzymes， digestion time and osmotic stabilizers. The results showed that T.controversa teliospores cultured in soil extract medium for 45 days and then transferred into T19 medium were most suitable for protoplast release. The mixture solution of 1.5% driselase， 1.5% lyase and 1.5% snailase was most favorable for protoplast preparation. The suitable incubation time with enzyme for the maximum release of protoplasts was 2.5 h at 28℃. The most effective osmotic stabilizer for the protoplast release was 1.2 mol/L KCl， and protoplast was also well dispersed. For the regeneration of the protoplast， TB3 medium was the best， which can produce more single colony under the same condition.

Key words Tilletia controversa； protoplast； preparation； regeneration

小麥矮腥黑穗?。╳heat dwarf bunt disease， DB）是由小麥矮腥黑粉菌Tilletia controversa Kühn（TCK）引起的重要國際檢疫性病害[1]，是麥類黑穗病中危害最大、極難防治的檢疫性病害之一，可對小麥生產(chǎn)造成毀滅性危害。小麥矮腥黑粉菌也是我國外來生物入侵研究的主要物種之一。感病植株通常矮化、多分蘗，麥粒內(nèi)含黑色、有魚腥味的冬孢子[2]。國內(nèi)外對于小麥矮腥黑穗病的研究主要集中在病原菌的鑒定、生物學(xué)特性及分子檢測技術(shù)等方面[38]，而對該病原菌的遺傳轉(zhuǎn)化研究較少。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是實現(xiàn)大規(guī)模定點突變的重要方法，利用該技術(shù)能夠使真菌的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，研究植物病原菌的致病機理。目前，進行真菌遺傳轉(zhuǎn)化的方法很多，常見的有聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合以及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化等[911]。原生質(zhì)體的制備和再生直接關(guān)系到轉(zhuǎn)化能否順利進行。小麥矮腥黑粉菌生長緩慢，其原生質(zhì)體制備較難成功，目前還未有小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體制備成功的報道。本試驗采用酶解細胞壁的方法制備了小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體，研究了原生質(zhì)體制備和再生的適宜條件，以期能穩(wěn)定快速地制備小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體，為建立該病原菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

小麥矮腥黑粉菌菌株，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所麥類真菌病害研究組保存并提供。

1.2 培養(yǎng)基

2%土壤浸提液培養(yǎng)基：稱取75 g滅菌土壤加500 mL沸水過濾后，加入20 g瓊脂粉，蒸餾水定容至1 L。

T19培養(yǎng)基：稱取磷酸二氫鉀613 mg，七水硫酸鎂246 mg，磷酸氫二鉀114 mg，氯化鈣55.5 mg，螯合鐵20 mg，七水硫酸鋅3.52 mg，五水硫酸銅0.38 mg，硫酸鎂0.31 mg，二水鉬酸鈉0.025 mg，氯化硫胺素5 mg， L-天冬酰胺3 mg，蔗糖20 mg，蒸餾水定容至1 L。固體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂粉。

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）：稱取PDA粉末（購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司）37 g，蒸餾水定容至1 L。

TB3培養(yǎng)基：酵母提取物3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，酵母粉10 g，蒸餾水定容至1 L。

以上培養(yǎng)基均經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20 min后使用。

1.3 常用試劑

溶壁酶（lysing enzyme）、崩潰酶（driselase）購自Sigma公司，蝸牛酶（snailase）購自上海生化所，硫酸鎂、氯化鉀、山梨醇、蔗糖以及T19培養(yǎng)基中的試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 試驗方法

1.4.1 小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體的制備

本試驗采用酶解細胞壁法制備小麥矮腥黑粉菌的原生質(zhì)體。用土壤浸提液培養(yǎng)基培養(yǎng)小麥矮腥黑粉菌冬孢子。用滅菌蒸餾水沖洗萌發(fā)的冬孢子轉(zhuǎn)入T19液體培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器中5℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)。離心收集菌絲，取1 g加入到不同組合的復(fù)合酶液中，28℃、180 r/min振蕩酶解。每隔30 min，用血球計數(shù)板觀察原生質(zhì)體，計算獲得率。設(shè)置菌絲培養(yǎng)時間、裂解酶系統(tǒng)、酶解時間、滲透壓穩(wěn)定劑以及適合再生的培養(yǎng)基等試驗參數(shù)，優(yōu)化原生質(zhì)體制備體系。

1.4.2 菌絲培養(yǎng)時間對小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體制備的影響

將在土壤浸提液培養(yǎng)基上萌發(fā)的小麥矮腥黑粉菌冬孢子轉(zhuǎn)接到T19液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)40、45、50、55、60 d，然后加入用1.2 mol/L氯化鉀配制的酶液（1.5%崩潰酶+1.5% 蝸牛酶+1.5% 溶壁酶），酶解3 h后觀察原生質(zhì)體獲得率，選出最適宜制備小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體的菌齡。

1.4.3 細胞壁裂解酶對小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體制備的影響

用1.2 mol/L氯化鉀分別配制1.5%崩潰酶、1.5%溶壁酶和1.5%蝸牛酶，將酶液加入到培養(yǎng)45 d的菌絲中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，3 h后計算原生質(zhì)體獲得率，研究單一酶和不同組合的酶對小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。

1.4.4 酶解時間對小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體制備的影響

將配制好的酶液（1.5% 崩潰酶+1.5% 蝸牛酶+1.5% 溶壁酶）加入到培養(yǎng)45 d的菌絲中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，設(shè)置酶解時間分別為1、1.5、2、2.5、3 h，顯微鏡檢觀察是否獲得原生質(zhì)體以及原生質(zhì)體的數(shù)量。

1.4.5 滲透壓穩(wěn)定劑對小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體制備的影響

分別選擇1.2 mol/L硫酸鎂、氯化鉀、山梨醇、蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑，以1.5%崩潰酶、1.5%溶壁酶和1.5%蝸牛酶為細胞壁裂解酶，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，酶解2.5 h，觀察不同滲透壓穩(wěn)定劑對小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體制備的影響。

1.4.6 小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體的再生

以1.5%崩潰酶、1.5%溶壁酶和1.5%蝸牛酶為細胞壁裂解酶，以1.2 mol/L氯化鉀為滲透壓穩(wěn)定劑，28℃、180 r/min振蕩酶解培養(yǎng)45 d的菌絲，將酶解2.5 h后所得原生質(zhì)體配制成濃度為1×105個/mL，取200 μL涂布在PDA和TB3平板上，5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察長出的單菌落。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel對所得數(shù)據(jù)進行處理，制作柱形圖和散點圖。利用DPS軟件將不同裂解酶種類下所得到的原生質(zhì)體數(shù)量進行LSD多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的釋放過程

在酶解初始階段，菌絲在裂解酶的作用下開始向內(nèi)凹陷，呈節(jié)狀斷裂（圖1a）。薄弱的細胞壁比較容易被酶解而發(fā)生變形，因此，原生質(zhì)體通常從細胞壁比較薄弱的位置釋放。顯微鏡下觀察可知，多數(shù)小麥矮腥黑粉菌的原生質(zhì)體從菌絲的頂端開始釋放（圖1b）。隨著酶解進行，細胞壁逐漸被完全酶解，原生質(zhì)體沒有細胞壁的束縛，在釋放后呈圓形透明的小球。小麥矮腥黑粉菌在酶解2.5 h后，大部分原生質(zhì)體從菌絲上釋放出來（圖1c）。

2.2 菌齡對原生質(zhì)體獲得率的影響

試驗結(jié)果表明，在相同處理條件下，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，原生質(zhì)體的數(shù)量呈先增后減的狀態(tài)，在菌齡為45 d時原生質(zhì)體數(shù)量達到最多，為12.0×105個/mL（圖2）。若培養(yǎng)時間較短或較長，均不利于原生質(zhì)體的大量生成。

2.3 裂解酶系統(tǒng)對原生質(zhì)體獲得率的影響

原生質(zhì)體的產(chǎn)量受細胞壁裂解酶的種類和濃度的影響較大，且混合酶的作用效率高于單一酶。在單一酶作用時，1.5%崩潰酶所得小麥矮腥黑粉菌的原生質(zhì)體數(shù)量最多，為3.0×105個/mL；1.5%溶壁酶所得原生質(zhì)體數(shù)量最少，為2.4×105個/mL；兩種酶混合時，原生質(zhì)體的數(shù)量比單一酶有所提高；三種酶混合時，得到的原生質(zhì)體數(shù)量最多，為11.5×105個/mL（表1）。因此，在小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體的制備中，選擇崩潰酶、溶壁酶和蝸牛酶三種酶混合使用效果較好。

2.4 酶解時間對原生質(zhì)體獲得率的影響

采用1.5%崩潰酶+1.5%溶壁酶+1.5%蝸牛酶為酶解系統(tǒng)，酶解3 h，每隔0.5 h觀察原生質(zhì)體的數(shù)量。結(jié)果表明：原生質(zhì)體數(shù)量隨著酶解時間的增加而先增后減，酶解2.5 h時原生質(zhì)體的數(shù)量達到最大值，為9.5×105個/mL。

2.5 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體獲得率的影響

不同類型的滲透壓穩(wěn)定劑對產(chǎn)生原生質(zhì)體制備的影響不同（圖4）。相同條件下，所選的4種滲透壓穩(wěn)定劑中無機溶劑比有機溶劑的原生質(zhì)體獲得率更高，且以山梨醇和蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑所得原生質(zhì)體易聚集（圖5）；以氯化鉀為滲透壓穩(wěn)定劑時所得原生質(zhì)體數(shù)量最多，為10.8×105個/mL。

2.6 原生質(zhì)體再生

小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體在PDA和TB3培養(yǎng)基上的再生情況不同（圖6）。在TB3培養(yǎng)基中5℃培養(yǎng)2周后長出單菌落，而在PDA上無單菌落長出，說明TB3培養(yǎng)基能夠再生出小麥矮腥黑粉菌，可用于小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)。

3 討論

本文優(yōu)化了小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體制備的條件，確定了制備原生質(zhì)體的最適宜條件：小麥矮腥黑粉菌冬孢子在土壤浸提液培養(yǎng)基上萌發(fā)后轉(zhuǎn)接至T19液體培養(yǎng)基，以培養(yǎng)45 d的菌絲作為原生質(zhì)體制備的初始材料，采用1.5%崩潰酶+1.5%溶壁酶+1.5%蝸牛酶酶解2.5 h，以1.2 mol/L氯化鉀為滲透壓穩(wěn)定劑，以TB3為再生培養(yǎng)基。

研究發(fā)現(xiàn)在小麥矮腥黑粉菌原生質(zhì)體制備中，原生質(zhì)體的數(shù)量隨著酶解的進行先增后減，在2.5 h時原生質(zhì)體數(shù)量達到最大值，若繼續(xù)酶解，原生質(zhì)體數(shù)量將減少，而且酶解時間過長會造成原生質(zhì)體破裂[1213]。真菌細胞壁成分復(fù)雜多樣，單一酶的裂解效果較差，在小麥矮腥黑粉菌的原生質(zhì)體制備中，選取3種酶混合時，原生質(zhì)體獲得率較高，這與周禮紅等人[14]的研究結(jié)果一致。本研究中，原生質(zhì)體的制備中以無機溶劑作為滲透壓穩(wěn)定劑的效果比有機溶劑好，且得到的原生質(zhì)體分散分布，這與玉米絲軸黑穗菌原生質(zhì)體制備的結(jié)果有差異[15]。

制備真菌原生質(zhì)體一般都采用新鮮的組織[16]。小麥矮腥黑粉菌的冬孢子需先在固體培養(yǎng)基中萌發(fā)，再將萌發(fā)長出的菌絲轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能獲得較多菌絲。小麥矮腥黑粉菌生長較慢，培養(yǎng)所用的時間較長，一般在固體培養(yǎng)基中萌發(fā)所需要的時間為30～35 d ，因此，在固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)45 d的菌絲屬于較幼嫩菌絲，比較適合破壁。小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)后先產(chǎn)生先菌絲和初生擔(dān)孢子，之后親和性初生擔(dān)孢子異宗配合，成對結(jié)合成“H”型，并產(chǎn)生侵染菌絲[17]，侵染菌絲易被酶解。如果培養(yǎng)時間過長，菌絲的細胞壁老化，成分改變，裂解酶系統(tǒng)對其作用不顯著，原生質(zhì)體的獲得率較低[18]。在小麥矮腥黑粉菌的原生質(zhì)體的制備中，應(yīng)該綜合考慮各方面的因素，優(yōu)化原生質(zhì)體的制備方法，以期為建立小麥矮腥黑粉菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] HOFFMANN J A. Bunt of wheat [J]. Plant Disease，1982， 66（11）： 979986.

[2] 周益林，段霞瑜，賈文明，等.小麥矮腥黑穗?。═CK）傳入中國及其定殖的風(fēng)險分析研究進展[J].植物保護，2007，33（2）：610.

[3] 梁再群， 郭翼奮， 朱穎初， 等. 根據(jù)統(tǒng)計分析冬孢子形態(tài)特性區(qū)分小麥矮腥黑穗病和網(wǎng)腥黑穗病的方法[J]. 植物保護學(xué)報， 1982， 9（4）： 243250.

[4] TYLER L J， JENSEN N F. Some factors that influence development of dwarf bunt in winter wheat [J]. Phytopathology， 1958， 44（10）： 565571.

[5] 王吉霞， 周益林， 段霞瑜， 等. 溫度對小麥矮腥黑穗病菌冬孢子萌發(fā)的影響[J]. 植物保護， 2006， 32（1）： 3840.

[6] MCDONALD J G， WONG E， WHITE G P. Differentiation of Tilletia species by rep-PCR genomic fingerprinting [J]. Plant Disease， 2000， 84（10）： 112125.

[7] 梁宏，張國珍，陳萬權(quán)，等.小麥矮腥黑穗菌與其近緣種的rDNA-ITS序列分析[J].植物病理學(xué)報，2005，35（S1）：181183.

[8] 梁宏，彭友良，張國珍，等.腥黑粉菌屬3種檢疫性真菌rDNA-IGS區(qū)的擴增及其序列分析[J].植物病理學(xué)報，2006，36（5）：407412.

[9] HINNEN A， HICKS J B， FINK G R. Transformation of yeast [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1981， 75（4）： 19291933.

[10]BLKER M， BHNERT H U， BRAUN K H， et al. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated integration （REMI） [J]. Molecular and General Genetics， 1995， 248（5）： 547552.

[11]SCHIESTL R H， PETES T D. Integration of DNA fragments by illegitimate recombination in Saccharomyces cerevisiae [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1991， 88（17）： 75857589.

[12]王賡，杜連祥.新月彎孢霉原生質(zhì)體制備及再生條件的研究[J].微生物學(xué)通報，1999，26（1）：2123.

[13]楊巖，龐家智，陳新民.小麥腥黑穗病和黑粉病[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

[14]周禮紅，李國琴，王正祥，等.紅曲霉原生質(zhì)體的制備、再生及其遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[J].遺傳，2005，27（3）：423428.

[15]寧平.PEG介導(dǎo)的玉米絲軸黑粉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化與ras、gpd啟動子的克隆[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[16]周益軍，范永堅，王金生，等.稻瘟病菌原生質(zhì)體的制備和再生菌株的致病性[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2000，16（2）：8387.

[17]蔚慧欣.小麥矮腥黑粉菌分子檢測體系的建立及侵染循環(huán)的觀察[D].綿陽：西南科技大學(xué)，2012.

[18]宋慶濤，張國珍，董金皋.玉米大斑病菌原生質(zhì)體的制備與再生[J].微生物學(xué)通報，2003，30（2）：4144.

（責(zé)任編輯：楊明麗）