小鵝瘟凍干卵黃抗體被動免疫持續(xù)期研究

李厚偉，孫林杰，孫永珍，曹艷杰，徐 進,3*>

(1. 河南后羿生物工程股份有限公司，鄭州 451161；2. 鄭州市獸用生物制品工程技術研究中心，鄭州 451161；3. 內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院，呼和浩特 010018)

小鵝瘟是由鵝細小病毒引起的一種高度接觸傳染性疾病，該病傳播速度快，發(fā)病率和死亡率可高達90%～100%[1]，主要侵害出殼后3～20日齡幼鵝和番鴨，可感染櫻桃谷鴨、騾鴨、麻鴨等[2]，給世界范圍內的水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經濟損失[3]。本病的控制措施主要是使雛鵝在出殼后的4～5周內產生足夠的免疫力[4]，目前主要依靠接種減毒活疫苗和滅活疫苗預防小鵝瘟，但是流行病學調查表明鵝細小病毒常呈潛伏感染并持續(xù)存在[5-6]。通過高免雞蛋提取的小鵝瘟特異性卵黃抗體可以有效的預防和控制本病發(fā)生[7]。同時，由于小鵝瘟卵黃抗體具有不激活補體，不結合類風濕因子，可避免補體系統(tǒng)的干擾及檢測假陽性的出現[8-9]，操作簡便，對產蛋率無影響等優(yōu)點，所以小鵝瘟卵黃抗體用于緊急預防接種具有較大的實踐意義[10-11]。小鵝瘟凍干卵黃抗體的免疫保護期是決定小鵝瘟免疫程序的關鍵因素，為此試驗選取不同抗體效價的小鵝瘟凍干卵黃抗體接種不同日齡的雛鵝，在接種后不同時間進行了攻毒保護相關性的研究，以確定不同效價的小鵝瘟凍干卵黃抗體在雛鵝體內的最佳免疫保護期。

1 材 料

1.1 小鵝瘟凍干卵黃抗體 鄭州市獸用生物制品工程技術研究中心制備，試驗組A：3批瓊擴效價為1∶16的卵黃抗體(批號為201701、201702、201703)；試驗組B：3批瓊擴效價為1∶32的卵黃抗體(批號為201704、201705、201706)；試驗組C：3批瓊擴效價為1∶64的卵黃抗體(批號為201707、201708、201709)；規(guī)格均為50羽份/瓶，2～8 ℃保存，有效期為36個月。

1.2 檢驗用強毒 小鵝瘟病毒W株E2代凍干毒，批號：150701001，病毒含量：每1.0 mL病毒液含104.17LD50，規(guī)格：1.0 mL/支， 由河南后羿生物工程股份有限公司鑒定、保管和供應。

1.3 雛鵝 1日齡、4日齡健康易感雛鵝購自商丘柘城縣金忠養(yǎng)殖農民專業(yè)合作社，試驗前對同批雛鵝經瓊脂擴散試驗抽樣檢查血清均呈陰性。

1.4 小鵝瘟瓊脂擴散試驗抗原 批號：2016001，由鄭州市獸用生物制品工程技術研究中心制備、鑒定、保存及供應。

2 方 法

2.1 1日齡雛鵝被動免疫保護期試驗 每批抗體頸部皮下注射1日齡健康易感雛鵝80只，0.5 mL/只，同時設同批1日齡健康易感雛鵝80只，每只頸部皮下注射生理鹽水0.5 mL作為攻毒對照；取同批1日齡健康易感雛鵝10只，不注射任何藥品作健康對照。分別于注射抗體后0、12、24、120、144、168、192、216 h，從每批抗體注射鵝中隨機抽取10只，連同攻毒對照組10只健康易感雛鵝分別注射小鵝瘟強毒W株，每只0.2 mL(含100 LD50)，隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察10日，記錄雛鵝死亡情況，并依據下式計算相對保護率。相對保護率=[1-(試驗組死亡率/攻毒對照組死亡率)]×100%。

2.2 4日齡雛鵝被動免疫保護期試驗 每批抗體頸部皮下注射4日齡健康易感雛鵝80只，1.0 mL/只，同時設同批4日齡健康易感雛鵝80只，每只頸部皮下注射生理鹽水1.0 mL作為攻毒對照；取同批4日齡健康易感雛鵝10只，不注射任何藥品作為健康對照。分別于注射抗體后0、12、24、120、144、168、192、216 h，從每批抗體注射鵝中隨機抽取10只，連同攻毒對照組10只健康易感雛鵝分別注射小鵝瘟強毒W株，每只0.2 mL(含100 LD50)，隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察10日，記錄雛鵝死亡情況，并依據下式計算相對保護率。相對保護率=[1-(試驗組死亡率/攻毒對照組死亡率)]×100%。

3 結果與分析

3.1 1日齡雛鵝被動免疫保護期試驗結果 1日齡健康易感雛鵝注射不同效價的卵黃抗體后，在8個不同的時間點注射小鵝瘟強毒W株，攻毒后觀察10日，計算相對保護率，結果見表1。

表1 1日齡雛鵝被動免疫保護期試驗結果Tab 1 Result of the passive immunological protection period in one-day-old goslings

如圖1所示，不同效價的卵黃抗體免疫后，在0 h立即攻毒，抗體即可對1日齡雛鵝產生較好的保護作用，且保護率為100%，持續(xù)至144 h相對保護率仍為100%；但是抗體注射168 h后再攻毒，瓊擴效價為1∶16的試驗組出現雛鵝死亡情況，且192 h和216 h攻毒，不同瓊擴效價的試驗組均有雛鵝死亡情況。由此可見，瓊擴效價為1∶16，對1日齡雛鵝的確實保護期至少為6日，且抗體效價越高，保護效果越好，攻毒保護率與卵黃抗體效價呈正相關。

3.2 4日齡雛鵝被動免疫保護期試驗結果 4日齡健康易感雛鵝注射不同瓊擴效價的卵黃抗體后，在8個不同的時間點注射小鵝瘟強毒W株，攻毒后觀察10日，計算相對保護率，具體結果見表2。

如圖2所示，在免疫不同瓊擴效價的卵黃抗體后，在不同時間點進行攻毒保護試驗，在0 h抗體對4日齡雛鵝即可產生100%的保護作用，這種保護效果可持續(xù)至144 h，但是卵黃抗體作為異源蛋白在雛鵝體內隨著時間延長而逐漸消失，從注射抗體168 h開始的攻毒保護試驗中，瓊擴效價為1∶16試驗組出現雛鵝死亡情況，至216 h各試驗組雛鵝均出現不同程度的死亡情況。由此可見，瓊擴效價為1∶16時，對4日齡雛鵝免疫保護期至少6日，且攻毒保護率與卵黃抗體效價具有正相關性。

圖1 1日齡雛鵝各組的平均免疫保護效率與免疫后接種小鵝瘟病毒時間點的相關性Fig 1 The correlation between the average immunization efficiency and the time points of after inoculation with the gosling virus in every group of one-day-old goslings

表2 4日齡雛鵝被動免疫保護期試驗結果Tab 2 Result of the passive immunological protection period in four-day-old goslings

圖2 4日齡雛鵝各組的平均免疫保護效率與免疫后接種小鵝瘟病毒時間點的相關性Fig 2 The correlation between the average immunization efficiency and the time points of after inoculation with the gosling virus in every group of four-day-old goslings

3.3 不同日齡雛鵝被動免疫持續(xù)時間結果統(tǒng)計 1日齡、4日齡健康易感雛鵝注射3種不同瓊擴效價的小鵝瘟凍干卵黃抗體后，分8個時間點攻擊小鵝瘟強毒株，攻毒后觀察10日，由表1、表2可知，小鵝瘟凍干卵黃抗體對雛鵝產生100%保護的保護期至少可持續(xù)144 h，對不同日齡的雛鵝自144 h后的被動免疫的持續(xù)時間進行統(tǒng)計，結果見表3。

可以看出，攻毒對照組雛鵝死亡90%以上，健康對照組雛鵝100%健活，試驗組A在注射抗體168 h后進行攻毒，對雛鵝的保護率在93.33%～96.67%之間，仍可提供高效保護，但在192 h～216 h之間，相對保護率為55.56%～76.67%，保護率顯著下降；試驗組B在168 h對1日齡及4日齡雛鵝的攻毒保護率仍為100%，至192 h下降為93.3%，但至216 h對4日齡雛鵝的攻毒保護率僅為66.67%，已不能確實保護健康易感雛鵝；試驗組C至192 h對1日齡及4日齡雛鵝的攻毒保護率仍為100%，至216 h對雛鵝的攻毒保護率仍在88.89%～93.33%之間，仍可有效抵抗小鵝瘟病毒的侵害。

4 討 論

小鵝瘟是雛鵝的一種高發(fā)致命病，其主要特征為腸栓塞[12]，7日齡以內的雛鵝最易感染，日齡越小的雛鵝發(fā)病率越高，且發(fā)病程度也越嚴重[13]。Zherong You等[14]利用重組的BHc免疫產蛋雞生產出抗BoNT/B的卵黃抗體，可以中和神經毒素的生物學活性，減少肉毒中毒的風險，研究人員已經成功將卵黃抗體應用于預防和治療各種微生物和生物毒素的感染[15]。臧玉婷等[16]利用瓊擴效價為1∶16的小鵝瘟卵黃抗體進行的攻毒保護試驗表明，3日齡雛鵝注射抗體后1日攻毒保護率為100%。試驗利用三種不同效價的卵黃抗體分別免疫不同日齡的雛鵝，在免疫后不同時間進行攻毒保護試驗，結果表明，小鵝瘟病毒與卵黃抗體同時注射，二者可在體內發(fā)生中和作用，由于此時小鵝瘟病毒尚未對組織器官造成實質性的侵害，卵黃抗體可對雛鵝起到保護作用，攻毒保護率可達100%，與臧玉婷等[16]的研究結果一致。

郭素茵[17]研究卵黃抗體對不同日齡雛鵝感染小鵝瘟的治療結果表明，卵黃抗體對小鵝瘟的治療效果與日齡呈負相關，在一定范圍內，日齡越大，治愈的幾率越低。閆妍[18]采用1.0 mL小鵝瘟精制卵黃抗體治療不同日齡輕度患病雛鵝，結果表明，1日齡治愈率為97.44%，4日齡治愈率為94.87%，7日齡治愈率為90.48%。利用不同效價的卵黃抗體分別對1日齡和4日齡雛鵝進行攻毒保護試驗，發(fā)現不同效價的卵黃抗體在不同的時間對1日齡雛鵝相對保護率均高于對4日齡雛鵝的相對保護率，其中瓊擴效價為1∶16的卵黃抗體在216 h對1日齡雛鵝的相對保護率為66.67%，高于對4日齡雛鵝的相對保護率55.56%，瓊擴效價為1∶32的卵黃抗體在216 h對1日齡雛鵝的相對保護率為76.67%高于對4日齡雛鵝的相對保護率66.67%，瓊擴效價為1∶64的卵黃抗體在216 h對1日齡雛鵝的相對保護率為93.33%高于對4日齡雛鵝的相對保護率88.89%。試驗表明，利用卵黃抗體預防和治療小鵝瘟，日齡越小，越早使用，效果越好。

蘭信海等[19]制備不同瓊擴抗體效價的小鵝瘟卵黃抗體進行攻毒保護試驗，發(fā)現瓊擴抗體效價越高，保護效果越好。臧玉婷等[20]研究小鵝瘟卵黃抗體效價與攻毒保護相關性試驗結果表明，雛鵝注射相同劑量不同瓊擴效價的卵黃抗體，隨著卵黃抗體瓊擴效價的升高，對雛鵝的保護率也隨之升高，抗體效價的高低與攻毒保護呈正相關。試驗中，瓊擴效價為1∶16的卵黃抗體在144 h的相對保護率為100%，瓊擴效價為1∶32的卵黃抗體免疫保護期可持續(xù)至168 h，而瓊擴效價為1∶64的卵黃抗體免疫保護持續(xù)期可達192 h，進一步驗證了卵黃抗體效價越高，對雛鵝的免疫保護持續(xù)期越長。但是卵黃抗體屬于異源蛋白，在雛鵝體內有一定的消長規(guī)律，而提高瓊擴抗體效價涉及到企業(yè)成本及生產工藝的改進，尋求二者的最佳平衡點，需要進一步的研究。

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