液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定阿維菌素粉中非法添加非潑羅尼的研究

楊修鎮(zhèn)，陳 玲，尹伶靈，劉少寧，牛華星，張呈軍

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250022)

阿維菌素粉收載于《獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)》(化學(xué)藥品、中藥卷)第一冊，為獸用殺蟲、殺螨劑，通過促進(jìn)r-氨基丁酸(GABA)釋放，增強(qiáng)神經(jīng)膜對CI-通透性，阻斷神經(jīng)信號傳遞，使肌肉細(xì)胞失去收縮能力而致蟲體死亡，對寄生于動物體內(nèi)的線蟲和節(jié)肢動物有極強(qiáng)的驅(qū)殺作用[1]。非潑羅尼(fipronil)是一種新型高效殺蟲劑，有觸殺、胃毒及內(nèi)吸作用，對跳蚤、螨、鱗翅目、同翅目、半翅目等害蟲有效，但環(huán)境毒理學(xué)發(fā)現(xiàn)其對生態(tài)環(huán)境具有潛在的危險性[2]，我國于2009年10月起禁用于農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)。2017年8月初，荷蘭爆出“毒雞蛋”事件，雞蛋受殺蟲劑非潑羅尼大范圍污染，持續(xù)發(fā)酵的歐洲“毒雞蛋”事件影響歐洲多國。阿維菌素粉是畜牧業(yè)臨床應(yīng)用廣泛的驅(qū)蟲藥，部分養(yǎng)殖場夏季常用于防治蠅蛆，為防止不法廠家為增強(qiáng)阿維菌素粉的效果在其中添加非潑羅尼給畜禽產(chǎn)品帶來安全隱患，農(nóng)業(yè)部緊急發(fā)布了2571號公告[3]，公布了獸藥中非法添加非潑羅尼檢查方法標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)主要適用于阿維菌素粉，采用高效液相色譜法測定，紫外光譜匹配定性。目前尚無采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定阿維菌素粉中非法添加非潑羅尼的報道。

1 儀器與材料

Waters Xevo TQ-S高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀；電子天平(感量0.01 g、 0.00001 g)；非潑羅尼對照品，批號20170328，含量98.5%，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；阿維菌素粉(批號20170301，山東天宇生物科技有限公司提供)。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件 色譜柱為C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相A：水；流動相B：乙腈；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫35 ℃。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Tab 1 HPLC Gradient Elution

2.2 質(zhì)譜條件 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]方法，電噴霧離子源；負(fù)離子掃描(ESI-)；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：400 ℃；脫溶劑氮?dú)饬魉伲?00 L/h；毛細(xì)管電壓：3 kV；測試藥物定性、定量離子對及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量經(jīng)調(diào)諧確定，具體見表2。

表2 定性、定量離子對及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量Tab 2 The qualitative and quantitative ion pair and the corresponding cone voltage and collision energy

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取非潑羅尼照品25 mg置25 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1 mg/mL的非潑羅尼對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液，加20%乙腈水溶液逐級稀釋成5 ng/mL的非潑羅尼對照品溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 稱取阿維菌素粉約1.0 g，精密稱定，置200 mL容量瓶中，加乙腈約150 mL，振搖5 min，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL置100 mL容量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置100 mL容量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

2.3.3 陰性樣品溶液制備 取不含非潑羅尼的阿維菌素粉(批號20170301，山東天宇生物科技有限公司提供)，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3.4 陽性樣品溶液制備 取不含非潑羅尼的阿維菌素粉(批號20170301，山東天宇生物科技有限公司提供)，每1 g添加非潑羅尼10 mg后，按供試品溶液制備方法制備陽性樣品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液、陽性樣品溶液、陰性樣品溶液各2 μL，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，在上述液相色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，陽性樣品溶液色譜中在與對照品色譜相應(yīng)的位置出相同的峰，陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 非潑羅尼對照品溶液色譜圖Fig 1 Chromatographic trace of fipronil standard solution

圖2 陽性樣品溶液色譜圖Fig 2 Chromatographic trace of positive sample solution

圖3 陰性樣品溶液色譜圖Fig 3 Chromatographic trace of negative sample solution

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取非潑羅尼對照品貯備液，用20%乙腈水溶液逐級稀釋成0.025、0.05、0.5、5、10、20 ng/mL的系列溶液，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，在上述液相色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以定量離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)(x，ng/mL)，進(jìn)行線性回歸分析。回歸方程為：y=53349x-6170.7(r2=0.9995)，結(jié)果表明非潑羅尼進(jìn)樣濃度在0.025～20 ng/mL范圍內(nèi)與定量離子峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 精密量取非潑羅對照品貯備液，用陰性樣品溶液逐級稀釋成0.025、0.05、0.5、5、10、20 ng/mL的系列溶液，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，在上述液相色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，與線性關(guān)系考察項(xiàng)相應(yīng)濃度所得的色譜圖進(jìn)行比較，相對偏差均小于3%，說明阿維菌素粉基質(zhì)不會對非潑羅尼產(chǎn)生顯著的影響，故采用直接外標(biāo)法定量。

2.7 檢出限與定量限 取不含非潑羅尼的阿維菌素粉(批號20170301，山東天宇生物科技有限公司提供)，添加一定量非潑羅尼，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，在上述液相色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定。滿足歐盟657號決議[5]規(guī)定的定性條件的最低添加量為本方法的檢出限，大于檢出限且定量離子色譜峰的信噪比(S/N)滿足在10∶1以上，并且回收率滿足80%～120%之間的最低添加量為本方法的定量限[6]。本方法的檢出限為0.04 mg/g，定量限為0.1 mg/g。

2.8 精密度與回收率試驗(yàn) 取不含非潑羅尼的阿維菌素粉(批號20170301，山東天宇生物科技有限公司提供)，每1 g分別添加非潑羅尼0.1、1、30 mg(低量添加系采用加入一定量的對照品貯備液來實(shí)現(xiàn)，例如每1 g用移液器加入100 μL的1 mg/mL的非潑羅尼對照品貯備液來實(shí)現(xiàn)0.1 mg/g添加 )，各平行5份，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，在上述液相色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，0.1、1、30 mg/g三個添加水平下，回收率在84.6%～112.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～7.7%。，結(jié)果見表3。

表3 精密度與回收率試驗(yàn)Tab 3 Precision and recovery test

2.9 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一陽性樣品溶液，于制備后0、2、4、6、12、24、48 h注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，在上述液相色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，非潑羅尼含量的RSD為4.2%，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 50批樣品檢測結(jié)果 對從獸藥GSP經(jīng)營部隨機(jī)購買的50批阿維菌素粉按照本研究建立的方法進(jìn)行檢測，結(jié)果均未檢出非潑羅尼。

3 討論與小結(jié)

目前家禽養(yǎng)殖場環(huán)境一般較差，糞便尚未完全做到無害化處理[7]，夏季蠅蛆滋生產(chǎn)生的傳染病嚴(yán)重影響了經(jīng)濟(jì)效益。應(yīng)將養(yǎng)殖場糞便及時清理，采用密封發(fā)酵處理等措施減少蠅蛆繁殖，而不是大量使用獸藥來控制蠅蛆。獸藥的大量使用除增加成本外，還會致使畜禽產(chǎn)品殘留量超標(biāo)危害食品安全。

我國已發(fā)布的其他標(biāo)準(zhǔn)中，農(nóng)產(chǎn)品中非潑羅尼的殘留檢測較為常見，例如SN/T 4039-2014出口食品中萘乙酰胺、吡草醚、乙蟲腈、氟蟲腈殘留量的測定方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法，采用了乙腈提取、HLB固相萃取柱凈化的方法。阿維菌素粉中非法添加非潑羅尼是以治療為目地的，添加量較大，因此，參照農(nóng)業(yè)部公告第2571號公布的獸藥中非法添加非潑羅尼檢查方法采取了直接溶解稀釋法。

農(nóng)業(yè)部公告第2571號公布的獸藥中非法添加非潑羅尼檢查方法采用紫外光譜匹配定性，物質(zhì)的紫外吸收光譜是其分子中生色團(tuán)及助色團(tuán)的特征，而不是整個分子的特征，如果物質(zhì)組成的變化不影響生色團(tuán)和助色團(tuán)，就不會顯著地影響其紫外吸收光譜[8]。本方法采用串聯(lián)質(zhì)譜的兩對離子定性，大大排除了假陽性的可能，定性更為準(zhǔn)確。非潑羅尼化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有-NH2等電負(fù)性較強(qiáng)的基團(tuán)，易于失去H得到負(fù)離子峰，因此，采用負(fù)離子掃描(ESI-)模式。儀器在由正離子模式向負(fù)離子模式切換時應(yīng)對系統(tǒng)進(jìn)行足夠的平衡，少量甲酸的存在會嚴(yán)重影響離子化，必要時可對插入流動相的管線及吸頭先進(jìn)行清洗。非潑羅尼極性較小，在色譜柱上保留較強(qiáng)，如果采用水-甲醇為流動相進(jìn)行梯度洗脫，分析時間較長，乙腈洗脫能力強(qiáng)，黏度較小，可有效降低色譜系統(tǒng)壓力，且在實(shí)際分析中能夠獲得良好的峰形，故采用水-乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

阿維菌素粉基質(zhì)較為簡單，基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)證明基質(zhì)不會對非潑羅尼產(chǎn)生顯著的影響，因此，采用了直接外標(biāo)定量的方法，且各添加濃度回收率能處于80%～120%之間，滿足定量要求。

從獸藥GSP經(jīng)營部隨機(jī)購買的50批阿維菌素粉均未檢出非潑羅尼，這與農(nóng)業(yè)部實(shí)施《獸醫(yī)獸藥經(jīng)營質(zhì)量管理規(guī)范》和以獸藥“二維碼”標(biāo)識為核心的獸藥追溯監(jiān)管工作有關(guān)。目前有些養(yǎng)殖場通過互聯(lián)網(wǎng)和物流渠道購買獸藥，獸藥管理部門難以對這種渠道的獸藥進(jìn)行有效監(jiān)管，應(yīng)加大這種獸藥的檢查力度。

本試驗(yàn)建立的阿維菌素粉中非法添加非潑羅尼檢查方法簡便、準(zhǔn)確、快速、靈敏，適用于阿維菌素粉中非法添加非潑羅尼的檢測。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李衛(wèi)平. 阿維菌素的研究進(jìn)展[J]. 中國藥學(xué)，2012，21(19): 108-110.

Li W P. Research progress of avermectin [J]. China Pharmaceuticals, 2012, 21(19): 108-110.

[2] 徐廣春，顧中言，楊玉清，等. 氟蟲腈的應(yīng)用和風(fēng)險研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2008，7(2): 1-5.

Xu G C, Gu Z Y, Yang Y Q,etal. Progress in Research on Risks of Pesticide Fipronil and Its Application [J]. Modern Agrochemicals, 2008, 7(2): 1-5.

[3] 農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2571號[S].

The Ministry of agriculture. Ministry of agriculture Bulletin No. 2571[S].

[4] 吳 成，任海雷，趙志強(qiáng)，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測芹菜中氟蟲腈及其代謝物殘留[J]. 福建分析測試，2016，5: 37-41.

Wu C, Ren H L, Zhao Z Q,etal. Determination of the fipronil and metabolites residues in celery by liquid chromatography/tandem mass spectrometry [J]. Analysis of Fujian tested, 2016, 5: 37-41.

[5] Commission Decision (EC) No 657/2002 of the European parliament and of the council[S].

[6] 胡貝貞，蔡海江，宋偉華，等. 茶葉中氟蟲腈等8種農(nóng)藥殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定及不確定度評估[J]. 色譜，2012，30(9): 889-895.

Hu B Z, Cai H J, Song W H,etal. Determination of eight pesticide residues in tea by liquid chromatography -tandem mass spectrometry and its uncertainty evaluation[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2012, 30 (9): 889-895.

[7] 朱鳳連，馬友華，周 靜，等. 我國畜禽糞便污染和利用現(xiàn)狀[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2008，14(13): 48-50.

Zhu F L, Ma Y H, Zhou J,etal. Analysis on present situation of pollution of animal excrement in china [J]. Anhui Agri.Sci.Bull, 2008,14(13): 48-50.

[8] 孫恩玲. 藥物分析中紫外光譜的定性定量方法及應(yīng)用[J]. 光譜儀器與分析，1991，1: 5-8.

Sun E L. Analysis of qualitative and quantitative methods and applications of UV spectrum [J]. Spectronic Instrumentation and Analysis, 1991, 1: 5-8.