氮源、碳源影響紅色糖多胞菌發(fā)酵的研究

張 萍，師文飛，黃文福，牛 春

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750100)

紅霉素( Erythromycin, Er)是由紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)合成的14元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，又被稱為robimycin 或e-mycin，包括ErA～ErF[1]，其中ErA的抑菌活性最高。紅霉素具有廣譜抗菌作用，其抗菌譜與青霉素相似[2]，對革蘭陽性菌尤其敏感，對葡萄球菌、化膿性鏈球菌、綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、梭狀芽孢桿菌、白喉桿菌等有較強(qiáng)的抑制作用，是治療耐藥性金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌感染而引起疾病的首選藥物，臨床上可用于治療對青霉素過敏的患者。近幾年紅霉素衍生物的興起，大大刺激了母體紅霉素的需求[3-4]。

我國紅霉素發(fā)酵水平屬低水平重復(fù)操作，與發(fā)達(dá)國家相比差距較大。目前國外發(fā)酵單位己達(dá)8000～12000 U/mL，而國內(nèi)大多企業(yè)紅霉素發(fā)酵水平卻一直在4000～5000 U/mL[5]。紅霉素發(fā)酵水平主要受工作菌種、培養(yǎng)基組成、發(fā)酵條件控制以及后期的分離提純條件等多方面因素的影響，國內(nèi)很多科技工作者從紅霉素發(fā)酵相關(guān)參數(shù)和調(diào)控入手，希望提高紅霉素發(fā)酵水平。對前期選育的一株高產(chǎn)紅霉素紅色糖多孢菌菌株培養(yǎng)基進(jìn)行了響應(yīng)面法優(yōu)化，以使其更好的發(fā)揮菌株的生長特性，進(jìn)一步提高發(fā)酵液中紅霉素產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 紅色糖多孢菌，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司技術(shù)研發(fā)中心菌種研究室選育、保藏的高產(chǎn)菌株EM15-15。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件[6]種子培養(yǎng)基：含淀粉、糊精、蛋白胨、葡萄糖、黃豆餅粉、NaCl、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCO3和油，pH7.00。250 mL搖瓶裝種子培養(yǎng)基30 mL，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)48～52 h。發(fā)酵培養(yǎng)基：含正丙醇、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、CaCO3、淀粉、糊精、黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、葡萄糖和油，pH7.00。250 mL搖瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基30 mL，接種量10%，28 ℃，220 r/min培養(yǎng)7 d。

1.1.3 主要試劑及原料 玉米漿購自華北制藥康欣股份有限公司；(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、糊精、蛋白陳和葡萄糖等，均為分析純；紅霉素對照品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號:130307，含量:883 U/mg。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液化學(xué)效價檢測方法 硫酸水解法[7]，發(fā)酵液經(jīng)離心后，根據(jù)確定好的倍數(shù)吸取一定量的濾液，用0.35%碳酸鉀液稀釋。然后，取稀釋液20 mL于分液漏斗中，加入醋酸丁醋20 mL，振搖30 min，放置分層，棄去下層水液，于丁醋液中加入無水硫酸鈉1g左右(可酌量多加使丁醋液澄清)，振蕩至透明。準(zhǔn)確吸取其上層脫水液10 mL于另一干燥的分液漏斗中，精確加入鹽酸(0.1 mol/L)10 mL，振蕩30 min，放置分層，把下層鹽酸水液放入試管中，從中吸取5 mL放入另一試管中，加入硫酸(8 mol/L) 5 mL，搖勻，放入50 ℃水浴中，保溫30 min取出冷卻，于483 nm測定吸光度值，以紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算發(fā)酵液紅霉素的化學(xué)效價。

1.2.2 Plackett-Burman實驗設(shè)計 選取(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCO3、淀粉、糊精、黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、葡萄糖和正丙醇11個因素，應(yīng)用Minitab 15進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計，從而篩選出影響紅霉素效價的主要因素。

1.2.3 最陡爬坡實驗(steepest ascent design) 根據(jù)Plackett-Burman實驗結(jié)果中各顯著影響因素效應(yīng)的大小設(shè)定步長及變化方向，以快速逼近最佳響應(yīng)區(qū)域。而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小確定，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。

1.2.4 響應(yīng)面法(response surface methodology) 依據(jù)Plackett-Burman實驗和最陡爬坡實驗確定的實驗因素與水平，采用Box-Behnken實驗設(shè)計發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析實驗。每個因素取三個水平，以(-1，0，1)編碼，根據(jù)相應(yīng)的實驗表進(jìn)行實驗后，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及多元回歸分析，方差分析及回歸方程的顯著性檢驗采用F檢驗，以P<0.05判定為顯著。多元回歸模型擬合度采用R-Sq表示，以R-Sq>0. 9判定為優(yōu)；擬合度失擬(Lack of Fit)以P>0. 05判定為失擬不顯著，說明回歸模型與數(shù)據(jù)擬合較好。最后在一定的水平范圍內(nèi)求取各因素的最佳值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅霉素發(fā)酵效價主要氮源、碳源影響因子的確定 在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上選用N=20的Placket-Burman實驗設(shè)計，對淀粉(A)、糊精(B)、玉米漿(C)、棉籽餅粉(D)、黃豆餅粉(E)、葡萄糖(F)、(NH4)2SO4(G)、MgSO4·7H2O(H)、CaCO3(J)、油(K)和正丙醇(L)11個因素進(jìn)行了考察，每個因素取高(+)、低(-)兩水平，高水平約為低水平的1.25倍，響應(yīng)值為紅霉素的效價(Y)，試驗設(shè)計及結(jié)果見表1，因素水平取值、效應(yīng)及顯著性分析見表2。

表1 N=20的Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Tab 1 N = 20 Plackett-Burman experimental design and results

表2 Plackett-Burman試驗因素水平及其主效應(yīng)分析Tab 2 Plackett-Burman test factor level and its main effect analysis

由表2可知淀粉、糊精、黃豆餅粉、玉米漿發(fā)酵液中紅霉素的效價有顯著性影響，其中糊精和黃豆餅粉影響極顯著。選出具有顯著性影響的4個因素做最陡爬坡試驗，這4個因素都有顯著負(fù)效應(yīng)，因此在以后的實驗中應(yīng)減少加量。

2.2 最陡爬坡實驗 接近最大響應(yīng)面區(qū)域，響應(yīng)面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分近似真實情形，要先逼近最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程。根據(jù)Plackett-Burman實驗結(jié)果，確定不顯著因素的水平，表現(xiàn)為正效應(yīng)的因素取高水平，表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)的因素取低水平。顯著因素的變化步長及方向的實驗設(shè)計及結(jié)果表明(表3)，第3組效價最高，因此以第3組的水平作為響應(yīng)面實驗的中心點(diǎn)。

表3 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Tab 3 The steepest slope test design and results

2.3 Box-Behnken設(shè)計及分析結(jié)果 根據(jù)Plackett-Burman實驗和最陡爬坡實驗得出淀粉52.0 g/L，糊精14.0 g/L，黃豆餅粉48.0 g/L，玉米漿15.0 g/L作為中心點(diǎn)，以紅霉素效價為響應(yīng)值(Y)，利用Minitab 15響應(yīng)面分析中的Box-Behnken設(shè)計，設(shè)計4因素3水平的實驗，各因素水平見表4，Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果見表5。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多項式方程：

Y=-306806+5167.81A+6777.17B-352.250E+19088.6C-44.3984A2-310.375B2-16.1719E2-495.250C2+52.6250AB+21.5000AE-152.625AC-23.6250BE+17.0000BC+69.9375CE

表4 因素水平編碼表Tab 4 Factor level coding table

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Tab 5 Box-Behnken experimental design and results

通過Minitab 15軟件對試驗數(shù)據(jù)和模型進(jìn)行分析，采用置信度為95% ，結(jié)果見表6?？梢钥闯?，該二次回歸模型極為顯著(P=0.000)，失擬項不顯著(P=0.1731)，說明模型與試驗擬合良好，可以用于紅霉素效價的分析和預(yù)測。方程的決定系數(shù)R-Sq=94.04%，說明模型可以解釋94.04%試驗所得發(fā)酵效價的變化，進(jìn)一步說明該模型擬合程度良好。

依據(jù)回歸方程，利用Minitab 15軟件繪出響應(yīng)曲面圖和等高線圖，結(jié)果見圖1和圖2。

表6 二次多項式的方差分析Tab 6 Variance analysis of quadratic polynomials

圖1 淀粉、糊精、黃豆餅粉和玉米漿對紅霉素效價交互影響的曲面圖Fig 1 Curve of interaction of starch, dextrin, soybean meal and corn steep liquor on erythromycin titers

圖2 淀粉、糊精、黃豆餅粉和玉米漿對紅霉素效價交互影響的等高線圖Fig 2 Contours of starch, dextrin, soybean meal and corn steep liquor on erythromycin titer interaction

等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強(qiáng)弱大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著[8]。淀粉-糊精的交互作用、淀粉-黃豆餅粉的交互作用、淀粉-玉米漿的交互作用以及黃豆餅粉-玉米漿的交互作用的等高線均呈橢圓形，表明淀粉-糊精、淀粉-黃豆餅粉、淀粉-玉米漿以及黃豆餅粉-玉米漿的交互作用均對紅霉素的效價有顯著性影響。利用Minitab 15軟件中的響應(yīng)優(yōu)化器對試驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析，得到淀粉含量為52.3 g/L、糊精含量為14.0 g/L、黃豆餅粉含量為45.3 g/L和玉米漿含量為14.6 g/L時，紅霉素效價(Y)預(yù)測最大值為7734 U/mL。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的驗證 根據(jù)最優(yōu)化結(jié)果配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分批次(3次)發(fā)酵，紅霉素發(fā)酵效價分別為7821、7709和7762 U/mL，均值7764 U/mL，與預(yù)測值7734 U/mL十分接近。同時，與原發(fā)酵培養(yǎng)基比較，紅霉素效價提高了12%。

3 討論與結(jié)論

在紅霉素的發(fā)酵生產(chǎn)中常采用的菌種為紅色糖多胞菌S.erythraea。1952年從具有不同抗生素活性的菌種中分離出S.erythraeaNRRL2338。起初該菌種的紅霉素產(chǎn)最僅為0.25～1.0 g/L。但在2005年有報道其產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到10～13 g/L[9]。在紅霉素產(chǎn)量提升的過程中，菌種選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化起著重要角色。目前，傳統(tǒng)的紫外誘變、氯化鋰誘變、離子注入等方法仍被生產(chǎn)企業(yè)用來提高紅霉素產(chǎn)量[10-11]。工業(yè)生產(chǎn)菌株多為經(jīng)過多次誘變后的高產(chǎn)菌株，但“誘變疲勞”效應(yīng)使傳統(tǒng)誘變方法很難在提高產(chǎn)物產(chǎn)量方面再有較大突破。因此，代謝工程手段漸漸成為企業(yè)提高紅霉素產(chǎn)量的突破口，紅霉素發(fā)酵工藝優(yōu)化已作為企業(yè)研究的重中之重。

紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成份為淀粉和黃豆餅粉[12]。在紅霉素工業(yè)生產(chǎn)中，降低原料成本是提高企業(yè)效益的有效手段，所以在國內(nèi)出現(xiàn)了較多的采用廉價氮源替代昂貴氮源的報道。王曉磊等采用玉米粉水解物作為碳源在30噸發(fā)酵罐規(guī)模上使發(fā)酵單位提高了5.8%，綜合成本降低了26.0%[13]。張金國等采用廉價A粉和B粉替代淀粉、葡萄糖和黃豆餅粉后在10噸罐規(guī)模下產(chǎn)量提高了6.11%[14]。Zou等在初始培養(yǎng)基中添加玉米漿促進(jìn)了菌體的前期生長，最終紅霉素效價提高了22.2%[15]。El-Enshasy等采用甘蔗糖蜜替代葡萄糖后結(jié)合補(bǔ)加正丙醇工藝使紅霉素產(chǎn)量提高了33.0%[16]。

研究采用響應(yīng)面法對紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源和碳源進(jìn)行了優(yōu)化。首先，用Plackett-Burman試驗設(shè)計法選出了對紅霉素效價有顯著性影響的4個因素，分別是淀粉、糊精、玉米漿和黃豆餅粉；然后用最陡爬坡試驗逼近最佳響應(yīng)面區(qū)域；最后通過Factors=4，Run=27的Box-Behnken設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化，得出紅霉素最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方：淀粉52.3 g/L、糊精14.0 g/L、黃豆餅粉45.3 g/L、玉米漿14.6 g/L、(NH4)2SO48.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、CaCO35.4 g/L、棉籽餅粉 20.0 g/L、葡萄糖 20.0 g/L、正丙醇 10.0 mL/L、油 20 mL/L，與華承偉等[6]做的優(yōu)化結(jié)果基本一致。優(yōu)化后的配方經(jīng)過發(fā)酵之后測得紅霉素效價為7764 U/mL，比原配方提高了12%。

參考文獻(xiàn)：

[1] Stassi D, Donadio S, Staver M J,etal. Identification of aSaccharopolysporaerythraeagene required for the final hydroxylation step in erythromycin biosynthesis [J]. Bacteriol, 1993, 175(1): 182-189.

[2] 陳 強(qiáng), 朱才娟. 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的臨床評價[J]. 中國藥房, 1995, 6(1): 32-34.

Chen Q, Zhu C J. The clinical evaluation of large cyclic lactone antibiotics[J]. Chinese Pharmacy, 1995, 6(1): 32-34.

[3] 施敏敏. 紅霉素發(fā)酵過程的控制技術(shù)[J]. 工業(yè)控制與應(yīng)用, 2009, 28(7): 18-22.

Shi M M. The control erythromycin Fed-Batch fermentation process[J]. Ndustrial Control and Applications, 2009, 28(7): 18-22.

[4] 李 嘯, 陳長華, 李友元. 紅霉素A發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2006, 37(6): 381-383.

Li X, Chen C H, Li Y Y. Erythromycin A optimization of fermentation conditions[J]. Chinese Journal of Pharmaceuticals, 2006, 37(6): 381-383.

[5] 劉 峰, 陳浦云, 陳祥明. 紅霉素高產(chǎn)突變株F1-57的選育及發(fā)酵工藝研究[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2003, 19(2): 61-64.

Liu F, Chen P Y, Chen X M. Screening and culturing of erythromycin productive strain F1-57 and its fermentation[J]. Journal of Fujian Normal University (Natural Science Edition), 2003, 19(2): 61-64.

[6] 華承偉,于江傲,謝鳳珍. 紅色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)紅霉素培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化[J]. 中國生物制品學(xué)雜志, 2011, 24(6): 728-736.

Hua C W, Yu J A, Xie F Z. Optimization of fermentation medium for erythromycin production of Streptomyces erythreus by response surface methodology[J]. Chinese Journal of Biologicals, 2011, 24(6): 728-736.

[7] 范代娣, 黨 政, 孫曉紅, 等. 紅霉素?fù)u瓶發(fā)酵實驗工藝條件[J]. 西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2000, 30(1): 43-44.

Fan D D, Dang Z, Sun X H,etal. The experimental study on technical and engineering parameters during shake flask fermentation for erythromycin production[J]. Journal of Northwest A & F University (Natural Science Edition), 2000, 30(1): 43-44.

[8] Thompson D D. Response surface experimentation[J]. Food Processing Preservation, 1982, 6(3): 155-188.

[9] Minas W. Production of erythrornycin withSaccharopolysporaerythaea, in: Bartedo, J. L. (Eds.)[M]. Microbial Process and Products. Hnmana Process Inc., Totowa, NJ, 2005: 65-90.

[10] 孟祥學(xué), 工鳳山. 糖多孢紅霉菌紅霉素高產(chǎn)菌種的誘變選育[J]. 食品與藥品, 2009, 11(4): 35-36.

Meng X X, Gong F S. Breeding of erythromycin high-yieldingSaccharopolysporaerythraeastrain[J]. Food and Drug, 2009, 11(4): 35-36.

[11] 虞 龍, 張 宇, 龔文靜, 等. 氯化鋰一紫外一離子束復(fù)合誘變紅霉素高出菌株研究[J]. 原子能科學(xué)技術(shù), 2011, 45(7): 780-784.

Yu L, Zhang Y, Gong W J,etal. Screening of erythromycin high-yielding strain by compound mutation of LiCl, UV and ion beam[J]. Atomic Energy Science and Technology,2011,45(7):780-784.

[12] 鄒美云, 朱衛(wèi)民, 于學(xué)琴. 紅霉素鏈霉菌1-25菌株的特性研究[J]. 中國抗生素雜志, 1989, 14(3): 187-191.

Zou M Y, Zhu W M, Yu X Q. Cultural characteridtic studies and selection of high erythromycin producing mutant ofStreptomyceserythreus1-25[J]. Chinese Journal of Antibiotics, 1989, 14(3): 187-191.

[13] 王曉磊, 劉建周, 廖志忠, 等. 玉米粉水解物作為紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的研究[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2003, 34(4): 167-169.

Wang X L, Liu J Z, Liao Z Z,etal. Maize meal hydrolysate as culture medium for erythromycin fermentation[J]. Chinese Journal of Pharmaceuticals, 2003, 34(4): 167-169.

[14] 張金國, 劉 翔. 紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J]. 中國抗生素雜志, 2006, 31(7): 406-416.

Zhang J G, Liu X. A Research on the improvement of medium composition for erythromycin fermentation[J]. Chinese Journal of Antibiotics, 2006, 31(7): 406-416.

[15] Zou X, Hang H F, Chu J,etal. Oxygen uptake rate optirnization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3scale[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(13): 1406-1412.

[16] EI-Enshasy H A, Mohamed N A, Farid M A,etal. Improvement of erythromycin production bySaccharopolysporaerythraeain molasses based medium through cultivator medium optimization[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(10): 4263-4268.