非諾貝特對(duì)DDC誘導(dǎo)的原發(fā)性硬化性膽管炎模型小鼠的預(yù)防作用及機(jī)制

林韓特，代曼云，華慧英，徐港銘，羅怡爽，劉愛明

（寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理藥理學(xué)系，浙江 寧波315211）

膽汁淤積是由于受環(huán)境、遺傳、藥物和生物性因素影響導(dǎo)致的膽汁形成、分泌和排泄異常，進(jìn)一步發(fā)展可演變?yōu)楦卫w維化、肝硬化和肝癌等一系列膽汁淤積性肝病。常見的膽汁淤積性肝病主要包括原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC），及各型病毒性肝炎所致膽汁淤積性肝?。?-2］，其中PSC以膽管周圍炎癥和膽汁淤積為病理特征，可能的發(fā)病機(jī)制是病毒、細(xì)菌或藥物等誘導(dǎo)的炎癥和膽管疾病以及少數(shù)遺傳免疫問題。國(guó)內(nèi)外對(duì)PSC發(fā)病機(jī)制和防治措施的研究較少，3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氫-2，4，6-三甲基吡啶（3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydrocollidine，DDC）誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝病被認(rèn)為更符合PSC的病理特征［3-5］，可用于PSC動(dòng)物模型的復(fù)制。

非諾貝特（fenofibrate）是過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα）激動(dòng)劑，是臨床治療高脂血癥的一線經(jīng)典藥物，其應(yīng)用歷史已有五十余年。該藥臨床治療高脂血癥的劑量為每天150～300 mg，在梗阻性黃疸肝損傷大鼠和原發(fā)性膽汁性肝硬化小鼠等膽汁淤積性肝病模型中，非諾貝特防治劑量多為50～200 mg·kg-1［6-8］。近年來發(fā)現(xiàn)，非諾貝特還可通過NF-κB等通路發(fā)揮抗炎作用［9］，但PPARα在低劑量非諾貝特抗炎中的作用特征與規(guī)律尚不明確。

本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)，每天2次ig給予非諾貝特25 mg·kg-1，預(yù)防給藥3 d能抑制JNK炎癥通路，有效預(yù)防α-荼基異硫氰酸鹽誘導(dǎo)的小鼠原發(fā)性膽汁性肝硬化，而高劑量（125 mg·kg-1）或低劑量（5 mg·kg-1）下均無效［10］。鑒于炎癥反應(yīng)在PSC發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，本研究擬以非諾貝特25 mg·kg-1，每天2次的給藥方案，觀察其對(duì)DDC誘導(dǎo)PSC的預(yù)防作用，為臨床治療膽汁淤積性肝病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

非諾貝特（湖南千金湘江藥業(yè)，C1603027，純度≥99%）；玉米油（上海阿拉?。?；DDC（STBG4282，純度99%，美國(guó)Sigma公司）；Trizol（美國(guó)Ambion-Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑和定量PCR試劑（北京康為世紀(jì)生物科技公司）；定量PCR儀（LightCycle 480，瑞士Roche公司）；谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT，2017041201）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvictransaminase，GPT，2017042001）、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP，2017092501）、總膽汁酸（total bile acid，TBA，2017090801）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL，2017021601）和直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL，2017022001）檢測(cè)試劑盒（寧波瑞源生物科技有限公司）；顯微鏡（BX43，日本奧林巴斯公司）。

1.2 動(dòng)物

129/Sv背景的Pparα基因敲除型小鼠，從美國(guó)國(guó)立癌癥研究院引進(jìn)，獲得了在國(guó)內(nèi)繁殖和使用授權(quán)，并在寧波大學(xué)動(dòng)物房與野生型進(jìn)行雜交和純化，獲得相同遺傳背景的野生型和全身Pparα基因敲除型小鼠（動(dòng)物合格證號(hào)2015000552973），體質(zhì)量21～25 g，飼養(yǎng)于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心SPF環(huán)境中，室溫21～25°C，濕度40%～70%，12 h晝夜循環(huán)，自由飲水?dāng)z食。

1.3 動(dòng)物分組、造模和藥物處理

將健康雌性野生型和Ppara基因敲除型小鼠各20只分別隨機(jī)分為4組，每組5只。非諾貝特對(duì)照組和非諾貝特預(yù)防組連續(xù)10 d每天2次ig非諾貝特25 mg·kg-1，PSC模型組則給予溶劑玉米油（據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，玉米油對(duì)炎癥和膽汁酸代謝無影響［11-12］）；給藥第4～10天，PSC模型組和非諾貝特預(yù)防組連續(xù)食飼含0.1%DDC的飼料誘導(dǎo)PSC，非諾貝特對(duì)照組和正常對(duì)照組正常飼養(yǎng)。

1.4 生化法檢測(cè)血清中肝功能指標(biāo)

末次給予非諾貝特24 h后，小鼠摘除眼球取血，將血液樣本4℃，1500×g離心15 min分離血清，-80℃冰箱保存。檢測(cè)時(shí)，將血清樣本置于冰上，按照試劑盒說明書采用速率法或終點(diǎn)法檢測(cè)小鼠血清中GOT，GPT，ALP，TBA，TBIL和DBIL含量。

1.5 HE染色觀察肝組織病理變化

小鼠取血后處死，切取1/2肝大葉（其余肝組織-80℃保存）置10%甲醛溶液中固定48 h后，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色后用樹脂膠封片，顯微鏡觀察肝病理形態(tài)學(xué)變化。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)肝組織膽汁酸代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)、炎癥及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA水平

取肝組織20 mg加入Trizol 500 μL勻漿，加入氯仿50 μL，4℃，13 000×g離心15 min后提取上層液，加入異丙醇50 μL沉淀，棄上清后加入75%乙醇（無RNA酶水配制）洗滌，加入適量DEPC水溶解提取總RNA。取總RNA 1 μg，加入逆轉(zhuǎn)錄試劑，普通PCR儀中反應(yīng)合成模板cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆?。取模板cDNA 1 μL，反應(yīng)混合物5 μL，上下游引物各0.2 μL，DEPC水3.6 μL，組成10 μL的反應(yīng)體系，在PCR儀中先95℃預(yù)變性10 min；再經(jīng)95℃變性10 s，60℃退火30 s和72℃延伸32 s共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果。以18S rRNA作為內(nèi)參，用得到的各基因的擴(kuò)增效率和各樣本的Ct值，采用2-△△Ct相對(duì)定量法計(jì)算基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。引物序列見表1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，采用GraphPad 7.03軟件做圖，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非諾貝特對(duì)DDC誘導(dǎo)的PSC模型小鼠血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，在野生型和Pparα基因敲除型小鼠中，模型組GPT，GOT TBA，ALP，TBIL和DBIL水平均顯著升高（P＜，Cyp7a1：cholesterol 7α hydroxylase；Cyp8b1：sterol 12α-hydroxylase；Oatp1：organic anion transporting polypeptide 1；Ntcp：Na+-taurocholate cotransporting polypeptide；Bsep：bile salt export pump；Mdr1α：multidrug resistance 1α；Ostβ：organic solute transporter β；IL-1β：interleukin-1β；Tnf-α：tumor necrosis factor-α；Socs3：suppressor of cytokine signaling；18S rRNA：18S ribosomal RNA.0.01），分別升高至相應(yīng)正常對(duì)照組的48，26，28，15，58和112倍（野生型），及10，8，20，4，20和62倍（基因敲除型），表明2種基因型小鼠出現(xiàn)肝細(xì)胞損傷和肝內(nèi)膽汁淤積，提示DDC誘導(dǎo)小鼠PSC模型復(fù)制成功。在野生型小鼠中，非諾貝特預(yù)防組上述指標(biāo)水平分別較模型組降低了96%，96%，91%，60%，98%和99%（P＜0.01），提示肝細(xì)胞受損和肝內(nèi)膽汁淤積得到改善；而在基因敲除型小鼠中，非諾貝特預(yù)防組對(duì)上述指標(biāo)無降低作用。2種基因型小鼠非諾貝特對(duì)照組以上指標(biāo)與正常對(duì)照組無明顯差異。

Tab.1 Sequence of primers

2.2 非諾貝特對(duì)DDC誘導(dǎo)的PSC模型小鼠肝組織病理改變的影響

如圖2所示，野生型和基因敲除型正常對(duì)照組小鼠肝外觀正常，無壞死，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；2種基因型小鼠模型組肝腫脹，淤血，膽汁淤積顏色深；肝組織內(nèi)大面積細(xì)胞染色加深，呈嗜酸性病變，膽管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞局灶性壞死，提示DDC誘導(dǎo)PSC模型成功。野生型小鼠預(yù)防組肝組織壞死灶和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減少。而基因敲除型小鼠預(yù)防組肝組織病理變化未見明顯改善。2種基因型小鼠非諾貝特組肝組織結(jié)構(gòu)均未見明顯病理改變。

2.3 非諾貝特對(duì)DDC誘導(dǎo)的PSC模型小鼠肝組織膽汁酸代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因mRNA水平的影響

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，在野生型小鼠中，模型組肝組織膽汁酸合成相關(guān)酶固醇12α羥化酶（Cyp8b1），膽汁酸相關(guān)攝取蛋白鈉離子-?；悄懰釁f(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（Ntcp）和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1（Oatp1）mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組分別降低95%，60%和87%（P＜0.01）；膽汁酸外排相關(guān)多藥耐藥蛋白Mdr1α和Mdr2以及有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體β（Ostβ）和多藥耐藥蛋白Mrp4 mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組分別升高90%和69%，80%和52%（P＜0.01）。在基因敲除型小鼠模型組和正常對(duì)照組中，上述指標(biāo)的變化趨勢(shì)與野生型小鼠一致。野生型小鼠中，預(yù)防組Cyp8b1和Ntcp mRNA表達(dá)較模型組分別上調(diào)了10和1.04倍（P＜0.05），Mdr1α，Mdr2和Ostβ mRNA表達(dá)水平下調(diào)64%，59%和90%（P＜0.01），而在基因敲除型小鼠中上述指標(biāo)均無明顯改變。在基因敲除型小鼠中，非諾貝特對(duì)照組Cyp8b1 mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組升高（P＜0.05），其他指標(biāo)均無顯著改變。

Fig.1 Effect of fenofibrate（Feno）on levels of total bile acid（TBA，A），alkaline phosphatase（ALP，B），total bilirubin（TBlL，C），direct bilirubin（DBlL，D），glutamic-pyruvictransaminase（GPT，E）and glutamic-oxaloacetictransaminase（GOT，F(xiàn)）in serum of mice with 3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydrocollidine（DDC）-induced primary sclerosing cholangitis（PSC）.Twenty female wild-type mice and Ppara-null mice were divided into normal control group，PSC model group，PSC+Feno group，and Feno group，respectively.Mice in PSC+Feno group and Feno group were treated with Feno 25 mg·kg-1twice per day for 10 d，and in PSC model group were ig given corn oil.Mice in PSC model group and PSC+Feno group were fed with 0.1%DDC-supplemented diet during the 4th-10thday，and in normal control group and Feno group were fed with normal commercial diet.x±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with PSC model group.

Fig.2 Effect of Feno on histopathological changes in hepatocytes of mice with DDC-induced PSC（HE staining）.See Fig.1 for the mouse treatment.The arrows show lesion locations.

2.4 非諾貝特對(duì)DDC誘導(dǎo)的PSC模型小鼠肝組織炎癥相關(guān)基因mRNA水平的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，在野生型小鼠中，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織白細(xì)胞介素1β（IL-1β），IL-2，IL-6，IL-10，Socs3，c-Fos和c-Jun mRNA表達(dá)水平分別升高4，5，5，6，3，27和13倍（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，預(yù)防組小鼠的上述基因mRNA表達(dá)水平分別下降了80%，85%，90%，77%，70%，95%和75%（P＜0.01）。在基因敲除小鼠中，模型組小鼠肝組織IL-1β，Socs3，c-Fos和c-Jun表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；而與模型組比較，預(yù)防組小鼠上述基因mRNA表達(dá)水平未見明顯改變。在2種基因型小鼠中，非諾貝特組上述指標(biāo)與正常對(duì)照組均無明顯變化（圖4）。

2.5 非諾貝特對(duì)DDC誘導(dǎo)的PSC模型小鼠肝組織凋亡相關(guān)基因mRNA水平的影響

Fig.3 Effect of Feno on mRNA levels of Cyp8b1（A），Cyp7a1（B），Ntcp（C），Oatp1（D），Mdr1α（E），Mdr2（F），Mrp4（G）and Ostβ（H）in mice with DDC-induced PSC.See Fig.1 for the mouse treatment.x±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with PSC model group.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，在野生型和基因敲除型小鼠中，模型組凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。在野生型小鼠中，非諾貝特預(yù)防組以上基因表達(dá)水平較模型組顯著降低（P＜0.01）；而在基因敲除型小鼠中無此效應(yīng)。Bcl-xl mRNA表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與Bcl-2和Bax一致，但在野生型小鼠中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在2種小鼠中，非諾貝特組上述3種凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平均與正常對(duì)照組無顯著差異。

Fig.4 Effect of Feno on mRNA levels of IL-1 β（A），IL-2（B），IL-6（C），IL-10（D），Tnf-α（E），Socs3（F），c-Fos（G）and c-Jun（H）in mice with DDC-induced PSC.See Fig.1 for the mouse treatment.n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with PSC model group.

Fig.5 Effect of Feno on mRNA levels of Bcl-2（A），Bax（B）and Bcl-xl（C）in mice with DDC-induced PSC.See Fig.1 for the mouse treatment.s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with PSC model group.

3 討論

本研究采用DDC食飼法誘導(dǎo)PSC小鼠模型。模型組小鼠血清GOT，GPT，TBA，ALP，TBIL和DBIL水平明顯升高；肝腫脹；經(jīng)HE染色，光鏡下可見膽管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞局灶性壞死。上述結(jié)果表明，食飼DDC方法可成功誘導(dǎo)小鼠PSC，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［13-14］。本研究中小鼠PSC造模成功率為100%。

炎癥反應(yīng)是PSC的典型特征，在全氟癸酸（perfluorodecanoic acid）誘導(dǎo)膽汁淤積模型小鼠的研究中，提示PPARα同時(shí)具有致炎和抗炎雙向作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，PSC模型組NF-κB炎癥信號(hào)通路激活，IL-1β，IL-2，IL-6和IL-10 mRNA表達(dá)增加，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［9］；此外，STAT3通路和JNK通路也不同程度地參與了DDC誘導(dǎo)PSC炎癥的發(fā)生。野生型模型組小鼠炎癥因子IL-2，IL-6，IL-10，c-Fos和c-Jun mRNA表達(dá)水平高于基因敲除型模型組，提示PPARα可能介導(dǎo)并加重PSC的炎癥，但2種基因型小鼠的模型組在血清生化指標(biāo)上無明顯差異。非諾貝特預(yù)防組小鼠轉(zhuǎn)氨酶（GPT和GOT）和炎癥因子mRNA表達(dá)在野生型小鼠中下降，而在基因敲除型小鼠中保持不變，提示非諾貝特基于PPARα對(duì)PSC產(chǎn)生抗炎作用。

膽汁酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)平衡是膽汁淤積性肝病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，有文獻(xiàn)報(bào)道，PPARα既可介導(dǎo)破壞膽汁酸合成、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的平衡，又可維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)［16-17］。Cyp7a1和Cyp8b1等CYP酶是膽汁酸合成代謝的關(guān)鍵酶。有研究報(bào)道，PPARα可通過調(diào)控其表達(dá)影響膽汁酸代謝穩(wěn)態(tài)［18］。也有文獻(xiàn)報(bào)道，PPARα在雌性小鼠體內(nèi)表達(dá)水平較雄性低，可能會(huì)下調(diào)CYP酶的表達(dá)［19］，因此本研究使用了雌性野生型和Pparα敲除型小鼠，以觀察PPARα對(duì)雌性PSC小鼠膽汁酸代謝穩(wěn)態(tài)的影響。研究結(jié)果顯示，2種小鼠正常對(duì)照組Cyp7a1和Cyp8b1 mRNA表達(dá)無明顯差異，其他膽汁酸代謝酶基因mRNA表達(dá)亦無明顯差異，提示在雌性小鼠中，Pparα基因敲除對(duì)膽汁酸代謝關(guān)鍵酶Cyp7a1和Cyp8b1基因表達(dá)無明顯影響。在2種小鼠中，PSC模型組均表現(xiàn)出血清生化指標(biāo)TBA，ALP，TBIL和DBIL升高及膽汁酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因mRNA表達(dá)異常，提示在DDC誘導(dǎo)PSC過程中破壞了膽汁酸穩(wěn)態(tài)，且該作用并不受PPARα調(diào)控。在野生型小鼠中，非諾貝特預(yù)防組可通過上調(diào)膽汁酸合成（Cyp7a1）和轉(zhuǎn)運(yùn)（Ntcp）相關(guān)基因，下調(diào)膽汁酸外排相關(guān)基因（Mdr1α，Mdr2，Mrp4和Ostβ）基本恢復(fù)膽汁酸穩(wěn)態(tài)；而在基因敲除型小鼠中，非諾貝特預(yù)防組的上述代謝和外排基因表達(dá)未發(fā)生改變。提示非諾貝特能作用于膽汁酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的代償調(diào)控，且該作用依賴于PPARα的介導(dǎo)。

綜上所述，非諾貝特可通過恢復(fù)膽汁酸的正常代謝，減輕膽管周圍炎癥反應(yīng)，減少肝組織損傷，預(yù)防DDC誘導(dǎo)的PSC，且其維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)和抗炎作用由PPARα介導(dǎo)。本研究結(jié)果提示，非諾貝特對(duì)預(yù)防和治療膽汁淤積性肝病具有良好的應(yīng)用前景。