阿替美唑不同種屬體外代謝產(chǎn)物鑒定比較及代謝通路研究

李 正，高 尤，楊春苗，仇曉燕，張?zhí)旌?，張文鵬，蘇瑞斌，莊笑梅

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京100850；2.海軍青島特勤療養(yǎng)中心，山東青島266071）

阿替美唑（atipamezole）是具有咪唑結(jié)構(gòu)的α2-腎上腺素受體拮抗劑［1］，能迅速扭轉(zhuǎn)由α2-腎上腺素受體激動劑誘導(dǎo)的鎮(zhèn)靜和麻醉作用，臨床上常被用來拮抗α2-腎上腺素受體激動劑（尤其是右美托咪定）的麻醉作用，同時還能有效地緩解美托咪定-咪達(dá)唑侖-氯胺酮聯(lián)合麻醉引起的不良反應(yīng)［2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，阿替美唑還對疼痛具有調(diào)節(jié)作用，可阻斷去甲腎上腺素能神經(jīng)通路疼痛傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致疼痛相關(guān)反應(yīng)的增加，但不影響持續(xù)性傷害性疼痛的刺激。肌內(nèi)注射阿替美唑（0.01～0.03 mg·kg-1）可增強(qiáng)雄性猴的性行為，增加射精量及性交次數(shù)［3］。基于以上作用，阿替美唑的開發(fā)與臨床應(yīng)用前景相當(dāng)廣闊，但目前尚未見有關(guān)阿替美唑藥物代謝特征研究的報道。

在早期藥物-藥物相互作用研究中，肝微粒體與重組人源細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）同工酶體外孵育體系是研究藥物代謝特征的重要體外模型，可用于鑒定代謝產(chǎn)物、研究代謝酶表型和代謝通路等［4］。本研究應(yīng)用不同種屬肝微粒體以及重組人源CYP同工酶體外溫孵模型獲得體外代謝產(chǎn)物；體外樣品采用Thermo Q-Exactive型超高效液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（ultra performance liquid chromatography coupled with linear ion trap-Orbitrap mass spectrometry，UPLC/LTQ-Orbitrap-MS檢測分析［5］，通過比對精確相對分子質(zhì)量和二級碎片離子信息鑒定阿替美唑在不同種屬肝微粒體以及重組人源CYP同工酶中的代謝產(chǎn)物，揭示其代謝轉(zhuǎn)化的種屬差異以及代謝通路，旨在為新藥的進(jìn)一步開發(fā)和可能的藥物相互作用研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

阿替美唑，白色粉末，批號：S160801，純度99.39%，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所合成；鹽酸普萘洛爾，白色粉末，批號：318-98-9，純度99.8%，購于（中國）北京百靈威科技有限公司。甲醇和乙腈（色譜純），購于美國Fisher Scientific公司；甲酸購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司；還原型輔酶Ⅱ（NADPH），批號：8516010103，購于美國Roche公司。

混合人肝微粒體（150人份，批號：38292）、大鼠肝微粒體（批號：7024004）和小鼠肝微粒體（蛋白濃度20 g·L-1，批號：7352001）購于美國BD Gentest公司。比格犬肝微粒體（蛋白濃度20 g·L-1，批號：1410114）購于美國Sekisui Xenotech公司；猴肝微粒體（蛋白濃度20 g·L-1，批號：NMZC）購于美國IVT公司。

重組人源CYP同工酶rCYP1A2+OR+b5（批號：3107807），rCYP2A6+OR+b5（批號：7116001），rCYP2B6+OR+b5（批號：626605），rCYP2C8+OR+b5（批號：8190001），rCYP2C9+OR+b5（批號：6257001），rCYP2C19+OR+b5（批號：6173002），rCYP2D6+OR+b5（批號：7114001），rCYP3A4+OR+b5（批號：5105002），rCYP2J2+OR+b5（批號：7311001），rCYP2E1+OR+b5（批號：6341001）和rCYP4F2+OR+b5（批號：8050001），購于美國BD Gentest公司（1000 nmol·L-1）。

1.2 主要儀器和設(shè)備

FRESCO21型離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）；XW-80A型漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；BS110S型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；Thermo Scientific Q Exactive質(zhì)譜聯(lián)用儀和Mass Frontier7.0軟件分析系統(tǒng)（美國Thermo Fisher科技公司）；UltiMate 3000型超高效液相色譜儀（美國戴安公司）。

1.3 肝微粒體與重組人源CYP同工酶體外溫孵實驗

不同種屬肝微粒體與重組人源CYP同工酶孵育實驗分為3組（n=3），依次為實驗組、陽性對照組和陰性對照組。實驗組為含阿替美唑的孵育體系；陽性對照組為含陽性探針底物（非那西丁、安非他酮、阿莫地奎、雙氯芬酸、S-美芬妥英、右美沙芬和咪達(dá)唑侖）的孵育體系，以確定反應(yīng)體系的活性；陰性對照組的孵育體系中不含NADPH，以確定阿替美唑在反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性。

1.3.1 肝微粒體孵育實驗

不同種屬（大鼠、比格犬和人）肝微粒體溶液中加入阿替美唑，置37℃水浴預(yù)孵育5 min后，加入NADPH啟動反應(yīng)，孵育體系中各成分終濃度為：阿替美唑50 μmol·L-1，肝微粒體蛋白1 g·L-1，NADPH 1 mmol·L-1，總孵育體積為800 μL。分別于加入NADPH啟動反應(yīng)后0和60 min加入2倍體積冰冷的含普萘洛爾（內(nèi)標(biāo)）30 mg·L-1的乙腈溶液終止反應(yīng)。將終止反應(yīng)的孵育樣品渦旋振蕩2 min后，4℃下13 800×g離心10 min，將上清液全部取至1.5 mL離心管，用氮?dú)獯蹈珊笥皿w積200 μL的流動相復(fù)溶，即為待檢樣品。

1.3.2 重組人源CYP同工酶孵育實驗

各重組人源同工酶（rCYP1A2，rCYP2B6，rCYP2C8，rCYP2C9，rCYP2C19，rCYP2D6，rCYP3A4和rCYP2A6）加入阿替美唑，置37℃水浴預(yù)孵育5 min后，加入NADPH啟動反應(yīng)，反應(yīng)體系中各成分終濃度為：阿替美唑50 μmol·L-1，重組酶濃度20 nmol·L-1，NADPH 1mmol·L-1，總體積800 μL。終止反應(yīng)及制備待檢樣品的條件與步驟同1.3.1。

1.4 UPLC/LTQ-Orbitrap-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為Phenomenex C1（8100 mm×2.1 mm，5 μm）柱；A相：0.1%甲酸水，B相0.1%甲酸乙腈；采用梯度洗脫（0～1 min，2%B；1～15 min，2%～95%B；15～17 min，95%B；17～20 min，2%B）；流速0.5 mL·min-1；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜采用電噴霧離子化源（electrospray ionization，ESI）正離子電離模式；霧化溫度300℃；離子傳輸管溫度325℃；鞘氣流速40 arb；輔助氣流速10 arb；噴霧電壓3.5 kV；碰撞電壓20，40和60 eV；質(zhì)荷比（mass-to-charge ratio，m/z）檢測范圍50～750；正離子檢測模式；采用高分辨全離子掃描模式；一級全離子掃描（分辨率R=70 000，掃描質(zhì)量范圍m/z 50～750），二級全離子掃描（分辨率R=17500）。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

高分辨全離子掃描模式下的總離子流色譜（total ion chromatogram，TIC）圖，運(yùn)用MetWorksTM1.3 SP4軟件進(jìn)行多重質(zhì)量虧損處理（multiple mass defect filters），發(fā)現(xiàn)新生成的代謝產(chǎn)物。利用Xcaliber4.0工作站，根據(jù)精確分子質(zhì)量數(shù)據(jù)推測可能的元素組成，并結(jié)合質(zhì)譜裂解碎片信息進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用分子式預(yù)測模塊預(yù)測所有母離子和碎片離子的分子式，鑒定阿替美唑的體外代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 各種屬肝微粒體阿替美唑代謝產(chǎn)物譜比較

通過對比各種屬肝微粒孵育實驗中0和60 min的TIC圖發(fā)現(xiàn)，阿替美唑的保留時間為6.5 min，經(jīng)肝微粒體代謝酶體外代謝后出現(xiàn)3個產(chǎn)物峰（圖1），其色譜行為一致，保留時間分別為4.9，5.4和8.0 min，依次命名為M1，M2和M3，其中M1和M2保留時間早于原型藥物，M3的保留時間落后于原型藥物。各種屬肝微粒體中3個產(chǎn)物的響應(yīng)強(qiáng)度不同，提示阿替美唑的代謝產(chǎn)物譜無種屬差異，但產(chǎn)物生成比例有一定種屬差異。

Fig.1 Comparative total ion chromatograms（TlCs）of atipamezole and its metabolites obtained from human（A），dog（B）and rat（C）liver microsomes before and after incubation.Blue curves represent incubation information obtained at 0 min，red curves represent incubation information obtained at 60 min.M1 is the metabolite of terminal ethyl hydroxylation，M2 is the metabolite of benzene epoxidation and M3 is the metabolite of imidazole epoxidation.

2.2 阿替美唑肝微粒體體外代謝產(chǎn)物鑒定

阿替美唑及其3個體外代謝產(chǎn)物的精確分子質(zhì)量與二級質(zhì)譜圖見圖2。圖2A中包含阿替美唑和3個代謝產(chǎn)物的母離子和子離子的碎片結(jié)構(gòu)解析；圖2B為阿替美唑的質(zhì)譜裂解綜合圖，數(shù)據(jù)見表1。由圖1和表1可知，在正離子模式下，阿替美唑準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+為m/z 213.13786，經(jīng)誘導(dǎo)碰撞解離（collision-induced dissociation，CID）裂解后，特征二級碎片離子包括m/z 69.04527，117.08976，145.10071和183.09106。其中碎片離子m/z183.09106為脫乙基的基峰，碎片離子m/z 145.10071為脫咪唑基峰，碎片離子m/z 117.08976為同時脫乙基和咪唑環(huán)后的苯并環(huán)戊基基峰，碎片離子m/z 69.04527為咪唑環(huán)基峰。

代謝產(chǎn)物M1的保留時間為4.9 min，準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+為m/z 229.13286，比阿替美唑［M+H］+多16 u，根據(jù)精確相對分子質(zhì)量，分子式為C14H16ON2，推測可能為阿替美唑氧化產(chǎn)物。M1的二級特征碎片離子包括m/z 81.04514，95.04914，143.08505和211.12239。由特征碎片離子m/z 211.12239推測該碎片可能為M1脫水峰，因此M1的氧化位點很可能位于乙基，結(jié)合氧化代謝性質(zhì)推測乙基末端發(fā)生羥基化的可能性較大，特征碎片離子m/z 143.08505為m/z 211.12239脫去咪唑環(huán)后末端形成乙烯結(jié)構(gòu)的基峰。由特征碎片離子m/z 95.04914推測，M1為脫水后形成環(huán)戊烯結(jié)構(gòu)后環(huán)戊烯開環(huán)形成咪唑環(huán)加乙烯結(jié)構(gòu)。特征碎片離子m/z 81.04514為m/z 95.04914再脫去甲基形成。

代謝產(chǎn)物M2保留時間為5.3 min，準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+為m/z 229.13290，比阿替美唑［M+H］+峰多16 u，根據(jù)精確相對分子質(zhì)量，分子式為C14H16ON2，推測M2也可能為阿替美唑氧化產(chǎn)物。M2的二級特征碎片離子包括m/z 69.04521，133.06451，161.09663和199.08592。由特征碎片離子m/z 69.04521推斷M2的咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)不變；而M2的特征碎片離子m/z 133.06451和161.09663均比阿替美唑特征碎片離子m/z 117.08976和145.10071多16 u，推測M2氧化位點很可能位于苯環(huán)處；特征碎片離子m/z 199.08592為M2脫乙基形成的基峰。

Fig.2 Tandem mass spectrometry（MS/MS）spectra of atipamezole（A），and its metabolites M1（B），M2（C）and M3（D）in human liver microsomes and proposed fragmentation patterns of atipamezole（E）.

Tab.1 Mass-to-charge ratio（m/z）of atipamezole and its major metabolites after incubation in liver microsomes

代謝產(chǎn)物M3保留時間為8.0 min，準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+為m/z 229.13292，比阿替美唑［M+H］+峰多16 u，根據(jù)精確相對分子質(zhì)量，分子式為C14H16ON2，推測M3也可能為阿替美唑氧化產(chǎn)物。M3的特征碎片離子包括m/z 85.04004，117.08976，145.10071和199.08603。由特征碎片離子m/z 117.08976，145.10071與阿替美唑的二級特征碎片離子一致推斷M3的苯環(huán)結(jié)構(gòu)不變；由特征碎片離子m/z 85.04004比阿替美唑咪唑基峰m/z 69.04527增加16u，推測該碎片可能為咪唑環(huán)氧化的基峰。因此，M3氧化位點可能位于咪唑環(huán)處，特征碎片離子m/z199.08592為M3脫去乙基形成的基峰。

2.3 阿替美唑在各重組人源CYP同工酶中的代謝轉(zhuǎn)化

在對比阿替美唑在各重組人源CYP同工酶孵育樣品中0和60 min的TIC圖中選擇提取離子m/z 229.13286得到圖3。結(jié)果顯示，除在CYP2A6，2B6，2D6，2C19和3A4外，阿替美唑在其他3個主要同工酶（CYP1A2，2C8和2C9）中不發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，并且不同重組人源CYP同工酶對應(yīng)不同的代謝產(chǎn)物。M1由CYP2A6，CYP2D6和CYP3A4介導(dǎo)產(chǎn)生，M2由CYP2A6，CYP2D6和CYP2C19介導(dǎo)產(chǎn)生，M3由CYP2A6，CYP2B6和CYP3A4產(chǎn)生。綜上，阿替美唑在肝重組人源CYP同工酶中的代謝通路如圖4。

Fig.3 Extracted ion chromatograms of the major metabolites of atipamezole in recombinant human cytochrome P450 enzymes（CYPs）

Fig.4 Supposed metabolic pathway of atipamezole in recombinant human CYPs.

3 討論

在新藥非臨床評價中，動物種屬的選擇非常重要。根據(jù)《FDA新藥安全性評價指南》要求［6］，化合物在非臨床受試動物中的代謝產(chǎn)物譜盡量與人體代謝產(chǎn)物譜一致，或不遺漏人體代謝產(chǎn)物，才能保證非臨床安全性評價結(jié)果的可靠性及臨床相關(guān)性。因此，新藥的代謝產(chǎn)物鑒定和產(chǎn)物譜的種屬比較是非臨床藥動學(xué)及安全性評價的重要研究內(nèi)容［7］。

3.1 阿替美唑Ⅰ相代謝產(chǎn)物譜的種屬比較

不同種屬體外肝微粒孵育實驗是獲得主要Ⅰ相代謝產(chǎn)物的重要手段，可以快速鑒定代謝產(chǎn)物并比較不同種屬產(chǎn)物譜［8］。本研究基于靈敏的測定肝微粒孵育體系中阿替美唑及其代謝產(chǎn)物的UPLC/LTQ-Orbitrap-MS方法，發(fā)現(xiàn)阿替美唑經(jīng)大鼠、比格犬和人肝微粒體孵育后都產(chǎn)生了3個主要代謝產(chǎn)物，特別是人肝微粒體孵育后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在大鼠和比格犬中均有產(chǎn)生，提示大鼠和比格犬可作為非臨床藥物安全性評價的動物種屬。雖各種屬中生成3個產(chǎn)物的質(zhì)譜響應(yīng)不同，但由于缺乏產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品，且質(zhì)譜檢測對基質(zhì)的敏感性較高［6］，無法準(zhǔn)確比較產(chǎn)物生成量。

3.2 阿替美唑Ⅰ相代謝產(chǎn)物初步鑒定

四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜通過測定各離子的振蕩頻率，運(yùn)用傅里葉變換計算m/z，其分辨率可達(dá)10萬。采用精確質(zhì)量數(shù)提取獲得相應(yīng)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)，充分保證了方法的高選擇性［9］。本研究采用UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)，基于多重質(zhì)量虧損方法，在20 min內(nèi)對鹽酸阿替美唑的3個代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離和鑒定。阿替美唑3個Ⅰ相代謝產(chǎn)物均為氧化產(chǎn)物，根據(jù)母藥的質(zhì)譜裂解規(guī)律，結(jié)合精確分子質(zhì)量數(shù)據(jù)推測可能的元素組成，逐一解析了產(chǎn)物的氧化代謝位點，包括乙基末端羥基化、苯環(huán)羥基化及咪唑環(huán)氧化。

3.3 阿替美唑的Ⅰ相代謝通路

應(yīng)用重組人源同工酶孵育后進(jìn)一步明確了阿替美唑在各同工酶中的代謝轉(zhuǎn)歸。阿替美唑在CYP2A6，2B6，2D6，2C19和3A4中轉(zhuǎn)化成不同的代謝產(chǎn)物（圖4）。Ⅰ相代謝通路研究結(jié)果顯示，CYP2A6，2B6，2D6，2C19和3A4均參與了鹽酸阿替美唑的氧化代謝，并且每個代謝產(chǎn)物都是有多個代謝酶亞型介導(dǎo)的。CYP2A6，2D6和2C19雖均有明顯的基因多態(tài)性［10-11］，但由于阿替美唑的多通路代謝，這種因素的影響可能較小。

綜上，本研究首次鑒定了阿替美唑的3個體外氧化產(chǎn)物，明確了參與Ⅰ相代謝的代謝酶亞型。由于阿替美唑代謝通路廣泛，在臨床與其他藥物合用時可能不易發(fā)生作為CYP藥物代謝酶底物介導(dǎo)產(chǎn)生的藥物-藥物相互作用［12-14］。在后期研究中還需要進(jìn)一步明確阿替美唑?qū)λ幬锎x酶的抑制和誘導(dǎo)作用，以評價基于代謝酶調(diào)節(jié)作用產(chǎn)生的藥物相互作用。