多柔比星體內(nèi)外對(duì)心肌甲基化轉(zhuǎn)移酶樣3依賴(lài)的m6ARNA甲基化修飾的影響

孟祥雯，張雪潔，張 波，2，李彩蓉，楊曉松

（湖北科技學(xué)院1.醫(yī)藥研究院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.臨床醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧437100；2.三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院，湖北宜昌443000）

蒽環(huán)類(lèi)抗生素多柔比星（doxorubicin，DOX）具有非細(xì)胞周期依賴(lài)性的廣譜抗腫瘤作用，是美國(guó)和歐洲癌癥指南推薦的一線(xiàn)化療藥物，在臨床上用于治療各種實(shí)體瘤及血液腫瘤，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、白血病和淋巴瘤等［1］。但因其具有累積性、劑量依賴(lài)性和不可逆性的心臟毒性作用而限制了它的臨床應(yīng)用，主要臨床表現(xiàn)為血壓降低、心動(dòng)過(guò)速和心律不齊，最終導(dǎo)致充血性心衰，嚴(yán)重威脅癌癥患者的生命［2］。然而，目前臨床上尚無(wú)有效的預(yù)防手段來(lái)改善DOX的心肌毒性。因此，闡明其心肌毒性的分子機(jī)制，將為尋找及開(kāi)發(fā)預(yù)防DOX心肌毒性的藥物提供理論依據(jù)。近年研究發(fā)現(xiàn)，在許多真核生物中，RNA存在150余種化學(xué)修飾如N6甲基腺苷（N6-methyl adenosine，m6A），m5A和m1A甲基化修飾等［3］，被修飾的RNA種類(lèi)包括信使RNA（messenger RNA，mRNA），核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA），轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA），微小RNA（microRNA，mRNA）和長(zhǎng)非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）等［4］，這些修飾通過(guò)調(diào)控RNA的拼接、出核、穩(wěn)定性和翻譯，最終調(diào)控機(jī)體生理生化過(guò)程，介導(dǎo)疾病的發(fā)生、器官和組織的發(fā)育［3］。m6A RNA甲基化修飾是真核生物中RNA化學(xué)修飾最為豐富的一種，約占總RNA修飾的80%［5］。隨著RNA甲基化檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步m6A RNA甲基化修飾機(jī)制及功能也逐步闡明。介導(dǎo)m6A RNA甲基化修飾主要由RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（讀入）和去甲基化酶（擦除）2類(lèi)功能蛋白的動(dòng)態(tài)相互作用調(diào)控，而m6A甲基化結(jié)合蛋白（讀?。┲苯诱{(diào)控靶RNA的拼接、穩(wěn)定性和翻譯，從而影響機(jī)體生理變化［4］。目前，有關(guān)m6A RNA甲基化修飾調(diào)控的研究主要集中在癌癥研究領(lǐng)域。已有研究顯示，在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣干細(xì)胞內(nèi)敲除甲基化轉(zhuǎn)移酶樣3（methyltransferase like 3，METTL3）和（或）METTL14，下調(diào)m6A甲基化修飾水平，導(dǎo)致癌基因如解整合素樣金屬肽酶19（ADAM metallopeptidase domain 19，AD-，AM19），促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞受體A3（erythropoietin-producing hepatocyte receptor A3，EPHA3），Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）的表達(dá)上調(diào)，而腫瘤抑制基因細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A），乳腺癌易感基因2（breast cancer susceptibility gene 2，BRCA2）和P53的表達(dá)下調(diào)，嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)、自我更新及腫瘤的發(fā)生［6］。體內(nèi)外研究結(jié)果顯示，METTL14的表達(dá)下調(diào)可降低mR-126的甲基化修飾水平，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移［7］。在心血管領(lǐng)域，首篇有關(guān)RNA甲基化修飾的報(bào)道認(rèn)為，脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)基因（fat mass and obesity associated gene，F(xiàn)TO）在心重構(gòu)與修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要功能，F(xiàn)TO介導(dǎo)m6A去甲基化修飾能改善心收縮功能，從而抑制心衰的發(fā)生［8］DOX心肌毒性機(jī)制研究普遍認(rèn)為，氧化應(yīng)激應(yīng)答介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和壞死是DOX心肌毒性的主要因素之一，涉及的毒理機(jī)制包括DNA損傷、線(xiàn)粒體功能障礙和能量代謝失衡等信號(hào)通路的調(diào)控［9］，而有關(guān)表觀遺傳修飾參與DOX心肌毒性調(diào)控機(jī)制的報(bào)道較少，特別是m6A RNA甲基化修飾是否參與DOX心臟毒性調(diào)控目前尚無(wú)報(bào)道。本研究擬用DOX誘導(dǎo)SD大鼠心肌損傷以及誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2損傷作為體內(nèi)外模型，評(píng)價(jià)其誘導(dǎo)心肌損傷過(guò)程中對(duì)m6A RNA甲基化修飾水平的影響和可能的機(jī)制，探索干預(yù)DOX心肌毒性的可能新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和主要儀器

40只SD雄性大鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。DOX粉末購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；大鼠心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自上海復(fù)旦IBS細(xì)胞資源中心；DMEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；兔抗人源METTL14單克隆抗體（#51104S）、兔抗人源活化的胱天蛋白酶3多克隆抗體（#9661S）和兔抗人源METTL3單克隆抗體（#96391S）購(gòu)自美國(guó)CST公司；大鼠抗小鼠β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（ab6276）、兔抗人源超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）多克隆抗體（ab13533）、兔抗人源核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）多克隆抗體（ab137550）和兔抗人源叉頭轉(zhuǎn)錄因子盒O3（forkhead transcription factor box O3，F(xiàn)oxo3a）單克隆抗體（ab109629）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（bs-0295G-HRP）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗大鼠IgM（bs-0368RHRP）抗體購(gòu)自北京博奧森公司；m6A RNA甲基化定量試劑盒（ab185912）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；細(xì)胞裂解液（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）、二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）、N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-Lcysteine，NAC）和二硫蘇糖醇（DTT）購(gòu)自碧云天公司；TRIzol、化學(xué)發(fā)光（electro-chemi-luminescence，ECL）顯影液和蛋白酶抑制劑（protease inhibitor cocktail）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 DOX誘導(dǎo)心肌損傷模型的構(gòu)建和分組

大鼠隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組10只，ip給予生理鹽水5 mL·kg-1，DOX組30只，ip給予DOX 2 mg·kg-1，均為隔天給藥1次，共給藥7次。未次給藥后，繼續(xù)喂養(yǎng)7周。大鼠處死取心臟，切取心尖置4%多聚甲醛中固定用于HE和Masson染色及免疫熒光分析，取左心室置液氮中凍透后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HE染色檢查大鼠心肌組織病理變化

將1.2中經(jīng)多聚甲醛固定的心肌組織進(jìn)行脫水處理，石蠟包埋、切片后置60℃烤箱中烘烤1 h，之后脫水、脫蠟，最后再采用HE染色，鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.4 Masson染色檢測(cè)心肌組織膠原纖維沉積

將1.3中制作的心肌組織切片脫蠟后用Weigert鐵蘇木精染液染核5～7 min，流水沖洗數(shù)分鐘，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗5 min，麗春紅酸性品紅染液染色3～4 min，流水沖洗，再用1%磷鉬酸溶液分化約5 min，甩干，直接用苯胺藍(lán)染液復(fù)染5 min，1%冰醋酸沖洗切片1 min，快速水洗后，乙醇脫水，二甲苯透明、風(fēng)干后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察有膠原物質(zhì)累積的部位，Masson染色為藍(lán)色。通過(guò)Image-Pro Plus V6分析軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以藍(lán)色膠原區(qū)域的積分吸光度（integrated absorbance，IA）值與整個(gè)圖像區(qū)域的面積比值表示膠原纖維累積。

1.5 Western蛋白印跡法檢測(cè)大鼠心肌組織METTL3，METTL14，F(xiàn)oxo3a，SOD，Nrf2和活化的胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)

從-80℃冰箱取出1.2中凍存的心肌組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA，冰浴條件下采用電動(dòng)勻漿機(jī)打碎組織，冰浴10～20 min，4℃條件下以12 000×g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP離心管，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度；進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，之后采用4℃條件下200 mA，3 h轉(zhuǎn)膜。用TBST洗膜3次，室溫用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（1∶1000）4℃孵育過(guò)夜，室溫條件下采用TBST洗膜3次，加入二抗（1∶5000）孵育2 h，TBST洗膜3次，用ECL顯影液處理，經(jīng)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析，用目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶IA值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織和H9C2細(xì)胞METTL3和METTL14 mRNA表達(dá)

從-80℃冰箱中取出1.2中凍存的心肌組織，加入TRIzol用電動(dòng)勻漿機(jī)打碎組織，然后加入1/5體積的氯仿，渦旋振蕩混勻后靜置10 min，4℃條件下12 000×g離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，加入等體積異丙醇，渦旋振蕩后靜置10 min，12 000×g，4℃條件下離心10 min，倒掉上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，12 000×g，4℃條件下離心5 min，吸干乙醇，通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，加入適量無(wú)RNA酶無(wú)菌水溶解沉淀，超微量核酸分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度，-20℃保存以備后續(xù)熒光定量分析。H9C2細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組（1%DMSO）和DOX 1 μmol·L-1組，孵育24 h后去除培養(yǎng)基，加入TRIzol裂解細(xì)胞，后續(xù)總RNA提取同上。

采用二步法進(jìn)行熒光定量PCR分析mRNA表達(dá)水平。先將抽提的總RNA約500 ng，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，SYBR Green作為熒光染料，β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，熒光定量PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平，用2-△△ct法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)。

1.7 免疫熒光法檢測(cè)大鼠心肌組織中METTL3蛋白表達(dá)

將1.3制備的心肌組織石蠟切片進(jìn)行微波抗原修復(fù)（枸櫞酸緩沖液，0.01 mol·L-1，pH6.0），然后滴加3%BSA室溫封閉30 min，甩去多余液體，滴加稀釋的一抗（1∶100），于4℃濕盒中孵育過(guò)夜。第2天用PBST沖洗切片3次，每次3 min，然后用吸水紙擦干，滴加稀釋的熒光（CY3）標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶100），濕盒中20～37℃孵育1 h。PBST沖洗切片4次，每次3 min，滴加DAPI避光孵育5 min；PBST沖洗切片4次，每次5 min，用吸水紙擦干，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察。通過(guò)Image-Pro Plus V6分析軟件進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以陽(yáng)性著色區(qū)域的IA與整個(gè)圖像區(qū)域的面積的比值進(jìn)行半定量分析。

1.8 Western蛋白印跡法檢測(cè)H9C2細(xì)胞METTL3，METTL14，F(xiàn)oxo3a，SOD，Nrf2和活化的胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)

大鼠心肌細(xì)胞H9C2以5×107L-1接種于6孔板，用含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1、鏈霉素100 mg·L-1以及pH7.2的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞匯合度達(dá)約90%，吸去培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS洗2～3次，加入胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；待細(xì)胞處理結(jié)束后，從培養(yǎng)箱拿出培養(yǎng)皿，吸去培養(yǎng)基，用冰浴PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解細(xì)胞10～30 min，然后用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管內(nèi)，4℃條件下以12 000×g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP離心管，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度；采用終濃度為1 μmol·L-1的DOX處理H9C2細(xì)胞24 h，分別在DOX處理的0，3，6，12和24 h收集細(xì)胞，抽提總蛋白，Western蛋白印跡法分析METTL3、METTL14和活化的胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平。H9C2細(xì)胞分為4組，細(xì)胞對(duì)照（0.1%DMSO）組，DOX 1 μmol·L-1組，NAC 0.5 mmol·L-1組和DOX 1 μmol·L-1+NAC 0.5 mmol·L-1組，處理H9C2 24 h后收集細(xì)胞，抽提總蛋白，分析SOD，Nrf2，F(xiàn)oxo3a，METTL3，METTL14和活化的胱天蛋白酶3的蛋白表達(dá)水平。后續(xù)蛋白表達(dá)檢測(cè)方法同1.5。

1.9 大鼠心肌組織和H9C2細(xì)胞中m6A RNA甲基化定量分析

采用m6A RNA甲基化定量試劑盒對(duì)抽提的總RNA進(jìn)行甲基化定量分析，根據(jù)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。大體步驟如下：從試劑盒中取出8聯(lián)管，每孔中加入80 μL結(jié)合緩沖液，然后加入約2 μL（200 ng）RNA溶液，輕輕混勻后置37℃孵育90 min；去上清，用150 μL的洗脫緩沖液洗滌3次，加入50 μL抗體，室溫孵育60 min，洗滌3次；加入50 μL檢測(cè)抗體，室溫孵育30 min，洗滌3次；加入50 μL增強(qiáng)溶液，室溫孵育30 min，洗滌5次；加入100 μL顯色液，室溫避光孵育10 min，加入100 μL終止溶液，在2～10 min內(nèi)置于酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的吸光度（A450nm）值。甲基化倍數(shù)關(guān)系計(jì)算公式：m6A（%）=〔（樣品均值A(chǔ)450nm-陰性對(duì)照均值A(chǔ)450nm）/RNA質(zhì)量（ng）〕/〔（陽(yáng)性對(duì)照均值A(chǔ)450nm-陰性對(duì)照均值A(chǔ)450nm）/陽(yáng)性對(duì)照RNA質(zhì)量（ng）〕×100%

1.1 0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DOX致SD大鼠心肌損傷病理變化

圖1結(jié)果顯示，大鼠心尖組織HE染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，DOX組心肌纖維排列出現(xiàn)紊亂，大量心肌細(xì)胞水腫，肌原纖維出現(xiàn)溶解，部分細(xì)胞核崩解；Masson染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組心肌纖維表面呈紅色，DOX組大鼠心尖組織中膠原纖維蛋白表面部分呈藍(lán)色，DOX組膠原纖維累積量（10.7±4.8）%相較于對(duì)照組（4.3±1.3）%增加約2.5倍（P＜0.05）。

2.2 DOX對(duì)大鼠心肌組織SOD，Nrf2和Foxo3a蛋白表達(dá)的影響

Western蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，相較于正常對(duì)照組，DOX組大鼠心肌組織中SOD，F(xiàn)oxo3a和Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.01，P＜0.05）。

Fig.1 Pathological changes in myocardial tissue of rats induced by doxorubicin（DOX）by HE and Masson staining.Rats were ip injected with normal saline or DOX（2 mg·kg-1），once every other day，for seven times，and then were fed for another seven weeks after the last administration.Arrows show the morphological change and collagen accumulation of myocardial tissue.

2.3 DOX對(duì)大鼠心肌組織METTL3和METTL14 mRNA和蛋白及活化的胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)的影響

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，DOX組METTL3的mRNA表達(dá)水平上升（3.1±0.8）倍（P＜0.01），但METTL14 mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異（圖3A和B）。Western蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，DOX組METTL3和活化的胱天蛋白酶3表達(dá)水平上升顯著（P＜0.01），而METTL14蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化（圖3C和D）。免疫熒光結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，DOX組心肌組織中METTL3蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）（圖3E和F）。以上結(jié)果表明，DOX誘導(dǎo)心肌凋亡的同時(shí)，上調(diào)METTL3蛋白表達(dá)而不影響METTL14蛋白表達(dá)。

Fig.2 Effect of DOX on protein expression of superoxide dismutase（SOD），nuclear factor-erythroid 2-related factor 2（Nrf2）and forkhead transcription factor box O3（Foxo3a）in myocardial tissue of rats by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B：semi-quantitative result of A.x±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control group.

Fig.3 Effect of DOX on mRNA and protein expressions of methyltransferase like 3（METTL3），METTL14 and cleaved-caspase 3 in myocardicl tissue of rats.See Fig.1 for the rat treatment.A and B：mRNA expression was detected by qRTPCR；C：protein expression was detected by Western blotting；D：semi-quantitative result of C；E：protein expression of METTL3 was detected by immunofluorescence（IF，×200）；F：semi-quantitative result of E.s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.4 DOX對(duì)H9C2細(xì)胞METTL3，METTL14和活化的胱天蛋白酶3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與細(xì)胞對(duì)照組比較，DOX 1 μmol·L-1組METTL3 mRNA表達(dá)水平約是細(xì)胞對(duì)照組的3倍（2.69±0.61，P＜0.01），而METTL14 mRNA表達(dá)水平略高于細(xì)胞對(duì)照組（1.37±0.11，P＜0.05）（圖4A和B）。圖4C和D結(jié)果表明，METTL3的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性上升（r=0.8211，P＜0.05），DOX處理24 h后，METTL3蛋白表達(dá)水平約是0 h的6倍（0 h：0.20±0.02，24 h：1.55±0.40，P＜0.01），但METTL14蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化；活化的胱天蛋白酶3的表達(dá)也依時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of DOX（1 μmol·L-1for 24 h）on mRNA（A and B）of METTL3 and METTL14 and protein expression（C and D）of METTL3，METTL14 and cleaved-caspase 3 in H9C2 cells by qRT-PCR and Western blotting，respectively.D：semi-quantitative result of C.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control or 0 h group.

2.5 抗氧化劑NAC對(duì)DOX誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞SOD，Nrf2，F(xiàn)oxo3a，METTL3和活化的胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)的影響

Western蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖5）表明，NAC 0.5 mmol·L-1單獨(dú)或聯(lián)合DOX（1 μmol·L-1）處理H9C2細(xì)胞24 h，與DOX組相比，聯(lián)合處理組上調(diào)SOD，Nrf2和Foxo3a蛋白表達(dá)（P＜0.05），抑制活化的胱天蛋白酶3的表達(dá)（P＜0.05）；另一方面，NAC也部分抑制DOX誘導(dǎo)的METTL3蛋白表達(dá)的上升（P＜0.05）。

Fig.5 Effect of DOX or DOX+N-acetyl-L-cysteine（NAC）on protein expressions of Nrf2，SOD，F(xiàn)oxo3a，METTL3 and cleaved-caspase 3 in H9C2 cells by Western blotting.H9C2 cells were treated with DOX 1 μmol·L-1alone or in combination with NAC 0.5 mmol·L-1for 24 h.B：semi-quantitative result of A.，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with DOX group.

2.6 DOX對(duì)心肌組織和H9C2細(xì)胞總m6A RNA甲基化修飾水平的影響

大鼠心肌組織m6A RNA甲基化檢測(cè)結(jié)果顯示（圖6A），正常對(duì)照組m6A RNA甲基化修飾比例為（35±6）%，DOX組總m6A RNA甲基化修飾水平升高至（51±4）%（P＜0.05）。DOX 1 μmol·L-1處理心肌細(xì)胞H9C2 24 h，并同時(shí)采用NAC 0.5 mmol·L-1進(jìn)行干預(yù)，m6A RNA甲基化水平檢測(cè)結(jié)果（圖6B）顯示，與DOX組相比，NAC與DOX聯(lián)合處理組心肌細(xì)胞內(nèi)總m6A RNA甲基化修飾水平從（55±5）%下降至（45±3）%（P＜0.05），提示NAC能部分抑制DOX誘導(dǎo)的m6A RNA甲基化修飾水平升高。

Fig.6 Effect of DOX or DOX+NAC on methylation modification of m6A RNA in total RNA of myocardial tissue of rats（A）and H9C2 cells（B）.See Fig.1 for the rat treatment and see Fig.5 for H9C2 cell treatment.s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal or cell control group；#P＜0.05，compared with DOX group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，DOX致大鼠心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，膠原纖維蛋白累積增加明顯，提示DOX誘導(dǎo)大鼠心肌毒性模型的建立。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，DOX抑制SOD及其上游信號(hào)調(diào)控分子Nrf2和Foxo3a蛋白表達(dá)，同時(shí)心肌內(nèi)凋亡信號(hào)分子活化的胱天蛋白酶3的累積增加，說(shuō)明DOX誘導(dǎo)心肌氧化應(yīng)激及胱天蛋白酶依賴(lài)的凋亡信號(hào)通路的活化可能是DOX心肌毒性的重要因素。但是，令人意外的發(fā)現(xiàn)，DOX能顯著增加心肌METTL3 mRNA和蛋白表達(dá)水平及其依賴(lài)的m6A RNA甲基化修飾水平。因此，METTL3及其介導(dǎo)的m6A RNA甲基化修飾有可能參與DOX心肌毒性調(diào)控過(guò)程。

在細(xì)胞水平，本研究結(jié)果表明，DOX上調(diào)H2C9細(xì)胞METTL3的表達(dá)并呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性，但不影響METTL14的表達(dá)；而NAC不僅能明顯改善DOX對(duì)抗氧化信號(hào)的抑制作用，還能減輕DOX誘導(dǎo)的METTL3表達(dá)上調(diào)以及METTL3依賴(lài)的m6A RNA甲基化修飾水平，提示METTL3及其介導(dǎo)的m6A RNA甲基化修飾可能與氧化應(yīng)激信號(hào)通路的調(diào)控相關(guān)，METTL3可能介導(dǎo)氧化應(yīng)激信號(hào)通路調(diào)控分子m6A RNA甲基化修飾水平及其表達(dá)，參與DOX心肌毒性的調(diào)控作用。

目前已有多篇報(bào)道顯示，細(xì)胞內(nèi)m6A RNA甲基化修飾動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持細(xì)胞正常生理功能發(fā)揮重要作用，涉及細(xì)胞周期、炎癥反應(yīng)和存活等調(diào)控［10-12］。機(jī)制研究認(rèn)為，m6A RNA甲基化修飾主要是通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運(yùn)、半衰期和翻譯等來(lái)發(fā)揮作用［11］。在心肌病研究方面，僅Mathiyalagan等［8］2018年首次報(bào)道，F(xiàn)TO依賴(lài)的m6A RNA去甲基化修飾調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)Serca2a mRNA表達(dá)及其依賴(lài)的胞內(nèi)鈣離子循環(huán)，在缺血性心衰及非缺血性心衰的發(fā)生中起重要調(diào)控作用，提示心肌細(xì)胞內(nèi)m6A RNA甲基化修飾動(dòng)態(tài)平衡在心肌病發(fā)生過(guò)程中有重要調(diào)控作用。因此，在DOX心肌毒性過(guò)程中，m6A METTL3可能介導(dǎo)氧化應(yīng)激或抗氧化信號(hào)調(diào)控分子的RNA甲基化修飾，從而影響其表達(dá)而干擾氧化應(yīng)激與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡，最終導(dǎo)致心肌病的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，DOX抑制心肌細(xì)胞抗氧化信號(hào)分子表達(dá)，上調(diào)METTL3表達(dá)及其依賴(lài)的m6A RNA甲基化修飾水平，而NAC改善DOX介導(dǎo)的抗氧化信號(hào)分子下調(diào)及凋亡的同時(shí)，下調(diào)METTL3表達(dá)及其依賴(lài)的m6A RNA甲基化修飾水平。這一結(jié)果表明，在心肌細(xì)胞內(nèi)，METTL3可能參與氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的凋亡過(guò)程，而METTL3依賴(lài)的m6A RNA甲基化修飾可能在mRNA水平調(diào)控氧化應(yīng)激或抗氧化信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)而發(fā)揮調(diào)控作用，但METTL3調(diào)控的靶基因目前還不清楚。該結(jié)果為后期深入研究m6A RNA甲基化修飾調(diào)控心肌病的機(jī)制研究提供新的思路。