OSAHS合并認知障礙患者肺泡巨噬細胞表達TREM2的研究

王耀煒 王惠芳 程旭東

西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院呼吸科（西安710038）

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstruc?tive sleepapnea?hypopnea syndrome，OSAHS）以睡眠過程中反復發(fā)生的低通氣及呼吸暫停導致低氧血癥、睡眠片段化為其特征。目前越來越多的證據(jù)表明OSAHS可引起患者不同程度的認知功能障礙，甚至與阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)生、發(fā)展相關［1］。髓樣細胞表達的觸發(fā)受體2（triggeringreceptor ex?pressed on myeloid cells，TREM2）是近年來發(fā)現(xiàn)的一個免疫球蛋白超家族受體，主要表達于巨噬細胞、中性粒細胞、小膠質(zhì)細胞等［2］，最新的研究表明TREM2 mRNA在認知障礙、AD患者中高表達，可能為AD的診斷提供新的生物學方法［3］。目前對于TREM2是否在OSAHS合并認知障礙患者肺泡巨噬細胞上表達，以及其表達變化是否與認知障礙相關的研究較少。本研究通過觀察TREM2 mRNA及其蛋白在OSAHS合并認知障礙患者AM上的表達規(guī)律，初步探討其作用機制，為將來防治OSAHS患者發(fā)生認知障礙奠定基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2014年9月至2016年5月就診于西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科并行多導睡眠圖檢測確診為OSAHS患者79例，其中男61例，女18例，年齡42～74歲，平均（58.15±5.43）歲，均符合中華醫(yī)學會呼吸病學分會睡眠呼吸疾病學組制定的睡眠呼吸暫停綜合征診斷標準［4］。所有受試者均無慢性阻塞性肺疾病、肺源性心臟病、急慢性心腦血管病、嚴重的軀體疾病或精神類疾病、慢性酒精中毒、嚴重肝病、肝性腦病、低血糖反應、糖尿病酮癥等與認知障礙相關的疾病。所有入選病例均由我科受培訓醫(yī)務人員應用MMSE量表評估，包括定向、記憶、計算、語言、視空間、運用、注意等方面，總分30分。并按照評估結(jié)果將入選病例隨機分為以下4組。A組（無認知障礙組MMSE≥27）；B組（輕度認知障礙21≤MMSE＜27）；C組（中度認知障礙10≤MMSE＜20）；D組（重度認知障礙MMSE ＜9）。4組入選病例患者年齡、性別比例、受教育程度、吸煙均無統(tǒng)計學差異，所有入選者均知情同意，并經(jīng)過我院倫理委員會通過。

1.2 AM的分離、提取、純化分別對A～D 4組患者行支氣管肺泡灌洗術，2%利多卡因經(jīng)滴鼻麻醉后，使用纖支鏡前端楔入患者右肺中葉支氣管開口處，注入37℃、0.9%生理鹽水100 mL，負壓回吸收量大于總量的40%為回收成功。使用Ficoll（GE醫(yī)療生物科學中國有限公司，中國）密度梯度離心和貼壁法原代分離BALF中肺泡巨噬細胞，經(jīng)過臺盼藍和吞噬試驗證實活性純度＞99%后，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)12 h后備用。

1.3 RT?PCR測定肺泡巨噬細胞TREM2 mRNA表達按Trizol試劑說明書分別提取各組AM總RNA，分別于核酸蛋白質(zhì)分析儀上測定各組各自總RNA的質(zhì)量和純度。各取3 μg總RNA經(jīng)M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA后進行PCR擴增。PCR引物設計如下：TREM2上游引物：5′?TG?GTCAGAGGGCTGGACTGT?3′，下游引物5′?TCCTG?GCTGGACTTAAGCTGTAG?3′，產(chǎn)物大小 120 bp；β?actin 上游引物：5′?AGCGGTTCCGATGCCCT?3′，下游引物5′?AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG?3′，產(chǎn)物大小123 bp。TREM2 PCR反應條件為94℃2 min，然后94℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。β?actin的PCR條件為：94 ℃3 min，94℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，30個循環(huán)。RT?PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Biometra全自動凝膠成像及分析系統(tǒng)分析，結(jié)果以光密度（OD）值表示TREM2 mRNA的相對表達量。

1.4 流式細胞儀檢測肺泡巨噬細胞TREM2蛋白的表達以上分離提取的四組患者AM分別進行流式細胞儀（BD公司）檢測，CellQuest軟件分析。

1.5 磁共振彌散張量成像測定四組患者額葉白質(zhì)FA值先行頭顱MR檢查，之后再行DTI。參數(shù)：MR為 27.3 ms的 TE，1 794 ms的TR，1 100 ms的TI，240 mm的FOV，0.5 mm的間距，1.0 mm的厚度等；DTI為704個采集層，16個序列方向，軸面掃描層與AC?PC線平行。圖像采用the Functool image analysis（AW4.4 workstation工作站）處理，通過圓形感興趣區(qū)（ROI）分析各組額葉白質(zhì)FA 值［5］。

1.6 統(tǒng)計學方法計量資料以均數(shù)±標準差表示，資料分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析，各組間多重比較采用最小顯著差法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組AM中TREM2 mRNA、TREM2蛋白表達TREM2 mRNA及蛋白表達量A組＜B組＜C組＜D組，各組兩兩比較均P＜0.05，見表1。

2.2 各組患者額葉白質(zhì)FA值比較A～D組患者額葉白質(zhì)FA值分別為（0.713±0.062）、（0.698±0.053）、（0.437 ± 0.051）、（0.238 ± 0.032），除 A、B組差異無統(tǒng)計學意義外，其余各組兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 TREM2 mRNA、TREM2蛋白表達水平與額葉白質(zhì)FA值相關性分析TREM2 mRNA及蛋白表達均與額葉白質(zhì)FA值呈負相關（r分別為-0.583、-0.472，均P＜0.05）。

3 討論

OSAHS是一種常見的睡眠呼吸障礙疾病，常伴有間歇性低氧血癥、夜間覺醒、白天嗜睡及認知功能障礙等癥狀和體征。國內(nèi)外的研究均發(fā)現(xiàn)OSAHS可影響人心理狀況改變，并可引起認知功能受損［6］。MORISSON等［7］利用腦電圖監(jiān)測OSAHS患者發(fā)現(xiàn)覺醒狀態(tài)下整個皮質(zhì)腦電圖頻率均減慢，且與夜間氧飽和度下降正相關，提示OSAHS認知功能損害具有廣泛性，同時發(fā)現(xiàn)OSAHS患者存在不同類型、不同程度的認知障礙，這與其病情程度存在一定相關性［8］。一些研究調(diào)查了OSAHS患者與認知功能障礙的關系，提示重度患者比輕中度患者更容易出現(xiàn)認知功能障礙［9］。TREM2在多種髓系細胞中表達，包括單核細胞、巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞等中［10］。既往研究中發(fā)現(xiàn)，多囊性脂膜樣骨發(fā)育不良并硬化性白質(zhì)腦病是一種TREM2基因突變的疾病，其主要臨床特點是癡呆和全身多發(fā)性骨囊腫［11］。此外，臨床研究中發(fā)現(xiàn)，在AD患者中存在TREM2基因的突變，TREM2基因突變會使人患晚發(fā)性AD的風險高3倍，TREM2與人類認知障礙密切相關［12］。TREM2是否與OSAHS患者認知障礙的發(fā)生相關是本實驗研究重點。

表1 肺泡巨噬細胞TREM2 mRNA及蛋白表達比較Tab.1 Comparison of TREM2 mRNA and protein expression in alveolar macrophages ±s

表1 肺泡巨噬細胞TREM2 mRNA及蛋白表達比較Tab.1 Comparison of TREM2 mRNA and protein expression in alveolar macrophages ±s

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05

組別A組B組C組D組例數(shù)21 23 20 15 TREM2 mRNA 5.38±0.26 7.82±0.38*9.38±0.63*＃12.57 ± 0.65*?！鱐REM2蛋白50.35±3.58 68.72±5.46*80.53±7.42*＃96.48 ± 8.35*＃△

腦白質(zhì)是大腦內(nèi)部神經(jīng)纖維聚集的地方，既往對認知功能的研究多集中于腦灰質(zhì)，近年越來越多的研究認為腦白質(zhì)同認知功能也存在著密切聯(lián)系。彌散張量成像（DTI）技術是近年來發(fā)展成熟的一種無創(chuàng)、自動、高效地評估腦白質(zhì)纖維完整性的方法。DTI可定量評估白質(zhì)纖維束受損程度，F(xiàn)A值主要反映白質(zhì)纖維束髓鞘完整性、致密性及平行性，F(xiàn)A值減低是白質(zhì)纖維變性的敏感指標［13］。對不同年齡人群腦白質(zhì)DTI的研究發(fā)現(xiàn)：隨年齡增長FA值下降，提示腦白質(zhì)構(gòu)成變化及完整性降低，且認知功能下降［14］。本實驗采用DTI技術檢測OSAHS合并認知障礙患者額葉白質(zhì)FA值，并分析其與TREM2 mRNA和蛋白表達的關系，初步探討TREM2在OSAHS患者發(fā)生認知障礙過程中的作用，為將來此類疾病的防治提供依據(jù)。

巨噬細胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組分，分布在人體的各個組織，在肺里稱“肺泡巨噬細胞”，在神經(jīng)系統(tǒng)稱“小膠質(zhì)細胞”，在骨組織稱“破骨細胞”。既往關于TREM2與認知障礙的研究多集中于破骨細胞與小膠質(zhì)細胞。PALONEVA等［15］的研究結(jié)果表明，TREM2具有抑制小膠質(zhì)細胞和破骨細胞內(nèi)細胞因子表達的作用，從而使中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)和骨骼組織中的炎癥反應受到抑制。SHARMA等［16］研究發(fā)現(xiàn)在OSAHS患者中AM的功能障礙變得更加嚴重，可能增加對疾病的易感性，所以本研究選擇提取、純化各組患者AM并檢測其TREM2的表達水平。

本研究結(jié)果顯示OSAHS合并認知障礙各組患者隨著認知障礙的加重，TREM2 mRNA及蛋白的表達量明顯增加，重度認知障礙組的表達量達到最高，各組組間比較均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與之相反，各組患者額葉白質(zhì)FA值隨著認知障礙加重明顯減小，相關分析顯示TREM2 mRNA及蛋白表達與額葉白質(zhì)FA值均呈負相關（r分別為?0.583、?0.472，P＜ 0.05）。從而初步推斷TREM2的表達在OSAHS合并認知障礙患者疾病發(fā)生、發(fā)展的過程中可能起重要作用，具體TREM2如何參與認知障礙過程中的調(diào)節(jié)機制目前尚不清楚。近期在有關TREM2與AD的研究中發(fā)現(xiàn)，AD患者外周血和AD模型動物腦內(nèi)TREM2水平顯著升高［17］，TREM2在腦中具有抗炎作用，其是通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞炎癥反應在AD發(fā)病過程中起重要作用。當機體受到內(nèi)外因素損害時，炎癥因子會激活小膠質(zhì)細胞膜上受體TREM2，其通過TREM2/DAP12信號通路，上調(diào)IL?10、IL?4等抑炎因子的表達，從而減少炎癥反應［18］，減輕對神經(jīng)細胞的損傷，從而減輕AD疾病的進展。當炎癥刺激因子表達過度時TREM2調(diào)節(jié)能力下降，促炎因子增多，增加對大腦的損害，TREM2可能是AD患者認知障礙發(fā)展過程中的保護性受體。從而我們初步推測OSAHS患者由于長期存在低氧血癥、高碳酸血癥等刺激因素可能導致慢性炎癥反應，炎癥因子激活AM表達TREM2，TREM2起初通過表達增加來抑制炎癥反應，抑制炎癥因子對神經(jīng)細胞的損害，減緩認知障礙發(fā)生速度，當OSAHS患者病情逐漸加重得不到及時治療時炎癥因子刺激作用增加，TREM2調(diào)節(jié)作用下降，炎癥因子對神經(jīng)細胞的損害持續(xù)加重最終導致認知障礙逐漸加重。至于TREM2調(diào)節(jié)OSAHS患者發(fā)生認知障礙過程中的具體分子生物學機制仍需進一步研究。

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