血紅蛋白Bart′s水腫胎兒綜合征誘導多能干細胞系的建立

冼業(yè)星 嚴金梅 陳玉嫦 李東至 孫筱放

1廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院，廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點實驗室（廣州510150）；2廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，產(chǎn)前診斷中心（廣州 510623）

地中海貧血（thalassemia，簡稱地貧）又稱海洋性貧血，是臨床常見的一組珠蛋白生成障礙性常染色體隱性遺傳性疾病。因其最早在意大利、希臘、馬耳他等地中海沿岸國家發(fā)現(xiàn)而得名，該種疾病在東南亞、地中海等地區(qū)較為常見。根據(jù)珠蛋白基因缺陷的不同分類，而以α地中海貧血和β地中海貧血兩種分型最為常見。其中α-地中海貧血是一組以珠蛋白合成減少，α-鏈/非α-鏈比例失衡為特征的遺傳性溶血性血紅蛋白病。在我國南方α-地中海貧血的高發(fā)區(qū)中，廣西、廣東、江西、四川和浙江各省的發(fā)病率分別為14.95%、4.11%、2.6%、1.92%和1.20%［1］。雖然產(chǎn)前診斷技術(shù)飛速發(fā)展，但是我國每年仍有不少的α-地貧患兒出生。血紅蛋白 Bart′s（Hb Bart′s）水腫胎兒綜合征是a-地中海貧血純合子型，是罕見的新生兒或胎兒嚴重溶血的致死型，自1960年起國內(nèi)外就開始有陸續(xù)報道［2］。正常人有4個α基因，即αα/αα，當 4 個α基因缺失時??/??即為Hb Bart′s胎兒水腫綜合征。最常見的缺失型如東南亞缺失型（??SEA）全部缺失了兩個α基因，即當一對夫婦均為此型時，則胎兒有1/4機會遺傳有Bart氏綜合征風險?；颊咴谔簳r期就出現(xiàn)了大量γ鏈合成γ4，因其對氧的親合力極高，導致組織缺氧而造成胎兒水腫綜合征，孕婦常在妊娠30～40周時便出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎或者胎兒在娩出后30 min內(nèi)死亡。東南亞缺失等位基因在華南地區(qū)人群中達4%～8%，而在泰國北部甚至高達14%［3-4］。

誘導多能干細胞（iPS）技術(shù)在2006年［5］出現(xiàn)，并在近幾年發(fā)展迅速，為再生醫(yī)學研究提供了一個理想的研究及治療模型。近年來，科學家們利用誘導多能干細胞分化的特性來進行向各種體細胞的分化以探討疾病發(fā)病機制和治療，如神經(jīng)細胞和造血細胞等［6-7］。而目前通過使用Hb Bart′s胎兒水腫綜合征疾病來源的誘導多能干細胞作為材料進行該病相關(guān)機制及治療研究尚未報道，因此本研究通過收集Hb Bart′s胎兒水腫綜合征孕婦羊水細胞，利用仙臺病毒來誘導建立誘導多能干細胞系，評估相關(guān)干細胞多能性，為下一步治療研究提供理想的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑細胞培養(yǎng)皿、15/50 mL離心管和凍存管（Corning），羊水培養(yǎng)基（AmnioMAX?TM?Ⅱ），PCR擴增試劑盒（北京天根），Knockout DMEM培養(yǎng)液、Knockout血清替代培養(yǎng)物、NEAA、GlutamaxTM 和 P/S（GIBCO），bFGF（Peprotech），Cy?toTune??iPS 2.0 Sendai重編程試劑盒（Life）、Trizol試劑（Invitrogen），PBS，mTeSR1（Stem cell），EDTA，胰酶，TritonX?100，DAPI染液（ROCHE），AP 染色試劑盒（上海斯丹賽），實驗用引物（上海捷瑞），抗體OCT4、SSEA4、TRA?1?81、SMA和AFP（Abcam），抗體SOX2、Nestin（ABGENT）。

1.2 儀器與設(shè)備激光共聚焦顯微鏡、倒置顯微鏡和體視顯微鏡（Nikon），臺式離心機（Eppendorf），恒溫水浴箱（Memmert），生物安全柜、移液槍、培養(yǎng)箱和-80℃冰箱（Thermo），PCR儀（ABI），電泳儀和凝膠成像分析儀（Bio?Rad），液氮罐（MVE），4/-20℃冰箱（Haier）。

1.3 羊水細胞的采集和培養(yǎng)胎兒診斷為純合性α-地中海貧血（??SEA/??SEA）的孕婦獲得知情同意之后，在妊娠16周時在超聲引導下進行羊膜穿刺術(shù)，抽取10 mL羊水，通過1 000 r/min離心5 min收集羊水細胞。棄上清，將細胞懸浮于4 mL羊水培養(yǎng)基中，將其轉(zhuǎn)移至6 cm培養(yǎng)皿中放置于含有5%CO2的37℃潮濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7～8 d后更換4 mL新鮮的培養(yǎng)基。在細胞達到80%～90%融合時進行細胞傳代培養(yǎng)，使用適量0.05%胰蛋白酶進行消化，并以1∶4的比例傳代到相對應(yīng)的培養(yǎng)皿中進行擴增培養(yǎng)。

1.4 誘導多能干細胞建系筆者使用CytoTune??iPS 2.0仙臺重編程試劑盒通過仙臺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將四種轉(zhuǎn)錄因子 OCT4，SOX2，KLF4 和 c?Myc（OSKM）轉(zhuǎn)入血紅蛋白Bart′s患者羊水細胞中。如圖1所示，轉(zhuǎn)導24 h后更換新鮮羊水培養(yǎng)基，后每隔一天更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)導后第7天時將其消化接種到提前準備滅活的小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）飼養(yǎng)層上。第8天后開始換液更換為新鮮的iPS培養(yǎng)基，以后每天更換新鮮的iPS培養(yǎng)基培養(yǎng)，并觀察克隆形成。待克隆長大后以機械切割的方式將其傳代擴增，將得到的克隆吸到用matrigel覆蓋的無菌培養(yǎng)皿中用mTeSRTM1繼續(xù)培養(yǎng)，前1～3代時待克隆長大后以機械切割的方法傳代擴增以去除分化的細胞，得到純化的iPSc后可使用EDTA進行消化傳代擴增及凍存。

1.5 iPSC多能性檢測

1.5.1 堿性磷酸酶檢測將細胞按1∶6～7比例傳代以稀釋細胞密度，4～6 d后使克隆長大后克隆之間有足夠間距以便于染色觀察。細胞足夠大后用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定10 min。再用PBS洗滌3次，加入堿性磷酸酶染色液在室溫下避光孵育30 min。最后用PBS洗滌顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5.2 免疫細胞化學染色細胞系使用4孔板上培養(yǎng)3～4 d后用4%多聚甲醛固定20 min，然后用PBS洗滌2次，使用透膜液0.1%的TritonX?100透膜20 min，加2%FBS?PBS室溫封閉1 h。用PBS洗滌細胞，細胞與混有OCT4（1∶200）、SSEA4（1∶100）、SOX2（1/100）和TRA?1?81（1∶200）的一抗在4 ℃下孵育過夜后，用PBS清洗3遍，再與相應(yīng)二抗在37℃下避光孵育2 h，用PBS清洗3遍后用DAPI染細胞核，共聚焦顯微鏡進行熒光拍照。

1.5.2 RT?PCR檢測多能性基因表達使用Trizol提取已建成的誘導多能干細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT?PCR檢測誘導性多能干細胞中胚胎干細胞標志性基因SOX2、NANOG、LIN28和OCT4的表達情況，用胚胎干細胞H1細胞系作為陽性對照，羊水細胞作為陰性對照。PCR反應(yīng)程序設(shè)置：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)擴增36次，最后72℃延伸7 min，得到的PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.5.3 誘導性多能干細胞擬胚體形成實驗誘導性多能干細胞經(jīng)1 g/L的Dispase消化成細胞團塊后，用擬胚體分化液重懸，鋪在低吸附的培養(yǎng)皿中，放置在37℃繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，隔天換液，觀察擬胚體形成情況。1周后將擬胚體轉(zhuǎn)移到0.1%明膠包被的細四孔板胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。1周后，進行免疫熒光化學染色，其中外胚層的標記物為Nestin，中胚層的標記物為SMA，內(nèi)胚層的標記物為AFP，在共聚焦顯微鏡進行熒光拍照。

1.5.4 免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成試驗檢測iPSCs的體內(nèi)分化潛能當在matrigel包被的無菌培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的iPSCs生長至70%的密度時，用dispase消化酶消化7 min，用1 mL槍頭將細胞團吹脫，用約100 μL的DMEM/F12和Matrigel混合液（1∶1）重懸細胞，在每只免疫缺陷性（SCID）小鼠的后大腿內(nèi)側(cè)下注射收集的細胞106個細胞，大約8～10周后，當小鼠腿部的腫塊直徑超過2 cm時處死小鼠分離腫塊。腫塊在福爾馬林中固定過夜，石蠟包埋并進行切片，使用蘇木精伊紅（HE）染色，最后顯微鏡下觀察3個胚層的形成情況并拍照記錄。

1.6 核型分析取傳代后3～4 d的iPSCs，加入0.25 mg/L秋水仙素，37℃孵育3 h。用0.05%胰酶把iPSCs消化成單細胞，1000 r/min離心5 min收集細胞，0.4%枸櫞酸鈉：0.4%KCl=1∶1的低滲液37℃下處理5 min；加入7滴新鮮配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3∶1）進行預固定，1 000 r/min離心5 min，棄上清，再加固定液，室溫繼續(xù)固定40 min；離心棄上清，加入200 μL的固定液后重懸細胞，進行滴片，使用吉姆薩染色10 min，用水輕輕沖洗，在室溫下風干，在顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄病毒誘導SCA3皮膚成纖維細胞產(chǎn)生誘導多能干細胞在轉(zhuǎn)導后11～14 d出現(xiàn)胚胎干細胞樣克?。▓D2B）。轉(zhuǎn)導后第21～22天（圖2C），克隆足夠大時，在顯微鏡下用機械法將獨立克隆切開，選擇典型的克隆挑取至鋪有matrigel的4孔板中，每個克隆接種到1個孔內(nèi)并用mTeSRTM1培養(yǎng)基培養(yǎng)，并記作P1代。適量擴增及凍存各個代次細胞。Hb Bart′s水腫胎誘導多能干細胞形態(tài)特征（圖2D）與人胚胎干細胞相似，細胞克隆呈扁平、致密，邊界明顯，核質(zhì)比例較大。

圖1 羊水細胞重編程示意圖Fig.1 Flow chart of amniotic fluid cell reprogramming

圖2 重編程前后細胞形態(tài)Fig.2 Cell morphology before and after reprogramming

2.2 Hb Bart′s水腫胎誘導多能干細胞iPSCs保留多能性及體外分化潛能本研究建立誘導的多能干細胞堿性磷酸酶染色呈陽性（圖3），表明誘導后細胞表達高水平的堿性磷酸酶。

誘導多能干細胞進行多能干細胞的標志物SSEA4，TRA?1?81，SOX2和OCT4均陽性，DAPI為核染顯示藍色熒光（圖4）。

圖3 堿性磷酸酶染色（Bar=100 μm）Fig.3 Alkaline phosphatase staining（Bar=100 μm）

圖4 誘導多能干細胞多能性表面特異性標志物Fig.4 Pluripotent surface?specific markers of iPS

RT?PCR結(jié)果顯示誘導多能干細胞表達人胚胎干細胞多能性標志基因SOX2、NANOG、LIN28和OCT4（圖5）

誘導多能干細胞通過自發(fā)分化形成擬胚體（圖），并可形成表達Nestin（外胚層，圖6A）、SMA（中胚層，圖6B）和AFP（內(nèi)胚層，圖6C）3個胚層。

圖5 RT?PCR 檢測細胞系中 SOX2、NANOG、LIN28和OCT4基因表達Fig.5 Detection of the gene expression of SOX2，NANOG，LIN28 and OCT4 in cell lines by RT?PCR

圖6 三胚層分化Fig.6 Differentiation of three germ layer

誘導多能干細胞注射到免疫缺陷小鼠8～10周后發(fā)現(xiàn)腹股溝處出現(xiàn)腫瘤。對畸胎瘤組織進行切片并HE染色表明，所形成的腫瘤存在包括有外胚層、中胚層和內(nèi)胚層三個胚層分化的組織（圖7）。

此外，筆者還對誘導多能干細胞進行核型分析（圖8），其在體外長期培養(yǎng)后仍能維持正常的二倍體核型。

3 討論

近幾年誘導多能干細胞（iPS）技術(shù)的迅速發(fā)展，為再生醫(yī)學研究提供了獲得病人自身體細胞來源的多能性干細胞的體外培養(yǎng)途徑，不但避免了外源細胞引起自身免疫排斥問題，而且規(guī)避了臨床上的倫理問題。經(jīng)過科學家們這幾年的研究，已經(jīng)成功建立起多種疾病病人特異性的iPS細胞系［8］。正是iPSc技術(shù)的發(fā)展，科學家們逐漸將其應(yīng)用到疾病治療方向上，如應(yīng)用這種技術(shù)來治療β地中海貧血取得重大進展，通過對自身iP?Sc進行修復，并最終使細胞能夠表達相應(yīng)的HBB蛋白［9-13］。但筆者同時也要看到iPS疾病模型的不足，如建成細胞所需要的時間成本及所用的轉(zhuǎn)導方式介質(zhì)對其后續(xù)的治療影響均需要考慮。

圖8 誘導多能干細胞核型Fig.8 Karyotypes of iPS

仙臺病毒為非整合方法，對于基因組來說是一種產(chǎn)生iPSC的安全方法，且相對其他誘導方法更為高效［14-15］。筆者通過使用仙臺病毒從Hb Bart′s的胎兒的人羊水細胞中建成了誘導多能干細胞，并對建立的干細胞進行了相關(guān)多能性檢測。堿性磷酸酶（AP）活性通常在胚胎干細胞等全能或多能干細胞表現(xiàn)較高，當胚胎細胞發(fā)生分化后，AP活性隨之降低，而筆者的細胞堿性磷酸酶染色結(jié)果呈陽性。另外，免疫熒光檢測也是干細胞多能性常用的典型檢測方法，如干細胞表面特異性標志物如SSEA4，TRA?1?81，SOX2和OCT4等，所建立的iPS均為陽性。同時對誘導多能干細胞的多能性標志基因SOX2、NANOG、LIN28和OCT4表達進行RT?PCR檢測亦提示為陽性。筆者還對細胞進行體外和體內(nèi)分化能力進行了評估，通過自發(fā)分化EB和畸胎瘤形成實驗，均形成外胚層、中胚層和內(nèi)胚層3個胚層，提示其分化的全能性。為了驗證所產(chǎn)生的細胞是否有變異，本研究對細胞進行了核型分析，結(jié)果顯示仍維持正常的二倍體核型。從筆者的實驗結(jié)果可以看到，均提示筆者成功建立了Bart′s水腫胎兒綜合征誘導多能干細胞。

α-地貧在我國南方地區(qū)為最常見的遺代傳病之一，特別是Hb Bart′s為致死性疾病，目前尚無根治方法，而只有通過產(chǎn)前診斷來進行預防性干預，一旦發(fā)現(xiàn)即選擇終止妊娠處理，若要治療這種疾病可能需要進行宮內(nèi)治療。隨著基因治療方法策略的發(fā)展［10，16-17］，結(jié)合誘導多能干細胞技術(shù)，可以用其來研究對應(yīng)疾病的病理機制，同時可為個體化治療方案提供基礎(chǔ)，利用修復遺傳病突變基因，獲得胎兒正常的iPS細胞，有望利用iPS技術(shù)對胎兒進行宮內(nèi)治療以減少出生缺陷所帶來的巨大經(jīng)濟和精神負擔。有了Hb Bart′s水腫胎兒綜合征細胞模型，將為筆者下一步探討該疾病研究及治療工作提供重要工具，可以先在細胞層面上進行探究以減少直接對病人試驗所帶來的傷害。

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