右美托咪定預(yù)給藥對切口痛大鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的影響

肖凡 羅振中 盧俊 陳受琳 黃丹 周斌 陳琴琴 華福洲

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科（南昌 330000）

膠質(zhì)細(xì)胞激活對急性疼痛的產(chǎn)生和維持起關(guān)鍵作用。脊髓背角的膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為參與了疼痛反應(yīng)［6］。脊髓的膠質(zhì)細(xì)胞主要是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。其在神經(jīng)系統(tǒng)功能中都扮演著重要作用，參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)［7］。近年來脊髓膠質(zhì)細(xì)胞在切口痛中的作用引起廣泛關(guān)注，外周組織損傷、手術(shù)損傷、炎癥和神經(jīng)損傷等因素都可以激活脊髓膠質(zhì)細(xì)胞。脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活不僅與術(shù)后機(jī)械痛敏的產(chǎn)生和維持有關(guān)，而且與異常性疼痛、痛覺過敏的產(chǎn)生和維持密切關(guān)系［1］。有研究表明抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活可以阻斷痛覺過敏狀態(tài)。圍術(shù)期使用麻醉鎮(zhèn)痛藥如氯胺酮及七氟醚等均可不同程度地抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活［2］。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是高選擇性α2?腎上腺素受體激動(dòng)劑，研究證實(shí)具有鎮(zhèn)痛作用［3］。然而右美托咪定對切口痛的影響及與膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系目前仍不清楚。本研究通過建立大鼠切口痛模型，觀察右美托咪定對脊髓膠質(zhì)細(xì)胞OX42、GFAP及炎性因子表達(dá)的影響，來探討右美托咪定在切口痛中的作用，從而為減輕切口痛的發(fā)生和發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料右美托咪定（批號：H20100250，江蘇恒瑞醫(yī)藥公司），小鼠抗大鼠OX42多克隆抗體（GBP公司，美國），兔抗大鼠GFAP多克隆抗體（UCL公司，美國），Real Eevision二抗檢測系統(tǒng)（TECH公司，美國），von Frey纖維絲（Stolting公司，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組清潔級健康成年雄性SD大鼠，體重200～220 g，取大鼠60只，隨機(jī)分為4組（n=15）：S組為假手術(shù)組，O組為手術(shù)對照組，D1、D2組分別為低劑量及高劑量右美托咪定組。O組、D1組和D2組大鼠行左后足切開術(shù)制備切口痛模型，D1、D2組于術(shù)前10 min分別腹腔注射右美托咪定 30 μg/kg及 50 μg/kg［3］。S組和O組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 大鼠切口痛模型的建立大鼠后爪趾部切口疼痛模型建立：參考BRENNAN［4］的方法，在吸入1.4%異氟醚麻醉（假手術(shù)組同等麻醉）平穩(wěn)后，用碘伏消毒大鼠右后爪，在足趾面用11#刀片從距足跟0.5 cm處向足趾部作一長約1 cm的縱形切口（略微旁開正中線），依次切開皮膚和筋膜，用眼科鑷挑起足底肌肉并縱向切割，但保持肌肉起止和附著的完整性，輕壓止血后用5-0尼龍線縫合2針以縫合皮膚，切口局部涂抹抗生素軟膏預(yù)防感染。手術(shù)結(jié)束后置入飼養(yǎng)籠，單獨(dú)飼養(yǎng)，保持飼養(yǎng)環(huán)境一致：室溫維持在20～25℃，正常晝夜節(jié)律，無強(qiáng)光和強(qiáng)噪聲刺激，自由飲水和攝食。

1.4 術(shù)后行為學(xué)觀察于建立后爪趾部切口疼痛模型的術(shù)前（T0）、術(shù)后2、6、12、24 h（T1-4）分別觀察機(jī)械縮足反射閾值（MWT）。MWT測定：按CHAPLAN法［5］應(yīng)用von Frey纖維絲測定大鼠右后足的機(jī)械縮足反射閾值。大鼠置于底部為金屬絲網(wǎng)格的實(shí)驗(yàn)籠中，用一套應(yīng)力不同并標(biāo)有刻度的von Frey纖維絲垂直刺激大鼠右后足掌底部靠近切口的區(qū)域，維持纖維絲輕度彎曲4～6 s或在大鼠出現(xiàn)行為反應(yīng)如縮足、逃避或舔足時(shí)停止刺激。從2.0 g的纖維絲開始，最大值為15.0 g，超過此值記為15.0 g，以up?down法推測閾值，在閾值上下各刺激5次，用內(nèi)推算法算出50%反應(yīng)閾值。每次刺激至少間隔15 s，并需等刺激引起的行為反應(yīng)完全消失后再給予下一次刺激。

1.5 Western blot行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組取3只大鼠應(yīng)用Western blot方法測定脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（OX42）和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（GFAP）的表達(dá)水平。在吸入1.4%異氟醚麻醉平穩(wěn)后，將大鼠置于冰上，快速取出L4-6脊髓后放入2 mL凍存管中，再迅速存入液氮中。脊髓組織按照1 mL/100 mg比例加入裂解液，制成勻漿，離心取上清液，采用BSA法進(jìn)行蛋白定量。取等量樣品進(jìn)行SDS?PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜分別與一抗室溫下孵育，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫下孵育，將膜與ECL發(fā)光底物接合，膜與膠片在暗室結(jié)合曝光、顯影、成像。所得結(jié)果掃描后用進(jìn)行定量分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參照β?actin灰度值的比值表示OX42和GFAP蛋白的表達(dá)。

1.6 脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量的測定取出脊髓后，迅速冷凍、稱重，加入預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的磷酸鹽緩沖液手動(dòng)勻漿，4℃下離心20 min后取上清液備用。采用ELISA法測定脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量的測定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)及組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠不同時(shí)點(diǎn)MWT值比較四組大鼠T0時(shí)MWT值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與S相比，O組大鼠T1-3時(shí)MWT值均下降（P＜0.05）；與O組相比，D1、D2組大鼠T1-3時(shí)MWT值均升高（P＜0.05）；與D1組相比，D2組大鼠T1-3時(shí)MWT值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 四組大鼠脊髓OX42及GFAP表達(dá)比較與S組相比，O組脊髓OX42表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），脊髓GFAP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與O組相比，D1、D2組脊髓OX42的表達(dá)表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），脊髓GFAP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

2.3 四組大鼠脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量比較與S組相比，O組脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量升高（P＜0.05）。與O組相比，D1、D2組脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量下降（P＜ 0.05）。見表2。

表1 四組手術(shù)前后MWT比較Tab.1 Compaerson of MWT before and after operation of four groups（n=15） x ± s，g

圖1 四組大鼠脊髓OX42及GFAP表達(dá)水平（n=6）Fig.1 Expression level of OX42 and GFAP in spinal cord for the four groups

表2 四組大鼠脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量Tab.2 Levels of IL?1β，IL?6 and TNF?α in spinal cord for the four groups（n=3） x ± s，pg/mg

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的大鼠后爪趾部切口痛模型是經(jīng)典的急性疼痛模型［4］。目前認(rèn)為右美托咪定主要通過增加神經(jīng)電刺激的閾值、減慢神經(jīng)刺激的傳播和減少動(dòng)作電位的升高率來阻滯神經(jīng)刺激的產(chǎn)生和傳導(dǎo)。有研究［5］證實(shí)右美托咪定不僅可以阻斷手術(shù)時(shí)疼痛的產(chǎn)生，而且可以較長時(shí)間影響機(jī)械痛敏，減少術(shù)中及術(shù)后阿片類藥物用量。本研究行為學(xué)研究結(jié)果顯示，腹腔注射右美托咪定可提高疼痛痛閾，減輕大鼠機(jī)械痛敏。

膠質(zhì)細(xì)胞激活對急性疼痛的產(chǎn)生和維持起關(guān)鍵作用。脊髓背角的膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為參與了疼痛反應(yīng)［6］。脊髓的膠質(zhì)細(xì)胞主要是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。其在神經(jīng)系統(tǒng)功能中都扮演著重要作用，參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)［7］。近年來研究［8-9］表明，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞與疼痛調(diào)制密切相關(guān)。OX42和GFAP分別是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的特異性標(biāo)志物［10］。在疼痛反應(yīng)中，目前認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞往往首先被激活，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞再作用于相鄰的星形膠質(zhì)細(xì)胞，可導(dǎo)致慢性痛疼反應(yīng)［11］。脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活往往發(fā)生在疼痛發(fā)展的早期階段，短暫且反復(fù)存在［12］；而星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活較晚且持久。本研究結(jié)果表明切口痛在大鼠脊髓背角OX42的表達(dá)上調(diào)，而GFAP卻沒有明顯變化，這提示急性疼痛與脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活有關(guān)；但筆者未發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化，可能與本實(shí)驗(yàn)選擇的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測時(shí)間有關(guān)。LIU等［13］研究也發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后切口痛的后期中星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著活化，可能與研究指標(biāo)的檢測時(shí)間在術(shù)后第3天相關(guān)。腹腔注射右美托咪定30 μg/kg及50 μg/kg均可抑制急性疼痛導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，但該劑量的變化無明顯差異，提示我們的實(shí)驗(yàn)還有待改進(jìn)。

脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活后，其釋放大量的細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)和神經(jīng)活性物質(zhì)，如 IL?1、IL?6、TNF?α等，而這些物質(zhì)又可反作用于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)大疼痛反應(yīng)，形成正反饋，導(dǎo)致炎癥過度反應(yīng)［14］。右美托咪定可通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，干預(yù)中樞炎癥［15］。本研究結(jié)果表明大鼠術(shù)后脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞IL?1β、IL?6和TNF?α含量明顯提高，而右美托咪定預(yù)給藥后可降低炎癥因子的分泌，提示右美托咪定可以通過抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活而降低了IL?1β、IL?6和TNF?α的分泌。

綜上所述，切口痛急性期脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞參與急性疼痛的發(fā)生發(fā)展；而右美托咪定可以通過抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活而減輕急性疼痛狀態(tài)。在急性痛模型中右美托咪定抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］DI CESARE MANNELLI L，PACINI A，MICHELI L，et al.Glial role in oxaliplatin ?induced neuropathic pain［J］.Experi?ment Neurol，2014，261：22?33.

［2］ZHOU T T，WU J R，CHEN Z Y，et al.Effects of dexmedeto?midine on P2X4Rs，p38?MAPK and BDNF in spinal microglia in rats with spared nerve injury［J］.Brain Res 2014，1568：21?30.

［3］ZENG X，WANG H，XING X，et al.Dexmedetomidine pro?tects against transient global cerebral ischemia/reperfusion in?duced oxidative stress and inflammation in diabetic rats［J］.PloS one，2016，11（3）：e0151620.

［4］ARORA V，MORADO ?URBINA CE，ASCHENBRENNER CA，et al.Disruption of spinal noradrenergic activation delays recovery of acute incision?induced hypersensitivity and increas?es spinal glial activation in the rat［J］.J Pain ，2016，17（2）：190?202.

［5］PENG M，WANG YL，WANG CY，et al.Dexmedetomidine attenuates lipopolysaccharide?induced proinflammatory response in primary microglia［J］.J Surg Res ，2013，179（1）：e219?225.

［6］JI R R，BERTA T，NEDERGAARD M.Glia and pain：is chronic pain a gliopathy［J］？ Pain，2013，（54 Suppl 1）：S10?28.

［7］NASERI K，SAGHAEI E，ABBASZADEH F，et al.Role of mi?croglia and astrocyte in central pain syndrome following electro?lytic lesion at the spinothalamic tract in rats［J］.J Mol Neuro?sci，2013，49（3）：470?479.

［8］HIRONAKA K，OZAKI N，HATTORI H，et al.Involvement of glial activation in trigeminal ganglion in a rat model of lower gin?gival cancer pain［J］.Nagoya J Med Sci，2014，76（3?4）：323?332.

［9］LIANG Y，QIU Y，DU J，et al.Inhibition of spinal microglia and astrocytes contributes to the anti?allodynic effect of elec?troacupuncture in neuropathic pain induced by spinal nerve liga?tion［J］.Acupunct Med ，2016，34（1）：40?47.

［10］ROMERO A，ROMERO?ALEJO E，VASCONCELOS N，et al.Glial cell activation in the spinal cord and dorsal root ganglia in?duced by surgery in mice［J］.Eur J Pharmacol，2013，702（1?3）：126?134.

［11］SHI Y，GELMAN B B，LISINICCHIA J G，et al.Chronic?pain?associated astrocytic reaction in the spinal cord dorsal horn of human immunodeficiency virus?infected patients［J］.J Neuro?sci，2012，32（32）：10833?10840.

［12］ZYCHOWSKA M，ROJEWSKA E，MAKUCH W，et al.The influence of microglia activation on the efficacy of amitripty?line，doxepin，milnacipran，venlafaxine and fluoxetine in a rat model of neuropathic pain［J］.Eur J Pharmacol，2015，749：115?123.

［13］LIU Y，HOU B，ZHANG W，et al.The activation of spinal as?trocytes contributes to preoperative anxiety?induced persistent post?operative pain in a rat model of incisional pain［J］.Eur J Pain，2015，19（5）：733?740.

［14］李文瑤，楊智勇，李玉萍，等.手術(shù)創(chuàng)傷對不同月齡大鼠認(rèn)知功能及海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2013，33（4）：421?423.

［15］ZHU Y J，PENG K，MENG X W，et al.Attenuation of neuro?inflammation by dexmedetomidine is associated with activation of a cholinergic anti?inflammatory pathway in a rat tibial frac?ture model［J］.Brain Res ，2016，1644：1?8.