伐瑞拉地在穩(wěn)定兔動脈粥樣硬化斑塊中的作用及其可能機制

范存靜 邱敬濤 張曉光 盧學峰

鄭州大學第二附屬醫(yī)院超聲科（鄭州 450014）

隨著人們物質(zhì)生活的改善，心、腦血管疾病的發(fā)生率越來越高，已經(jīng)成為中老年人的主要死亡原因之一［1-2］。大量研究［3］顯示，動脈粥樣硬化是心、腦血管疾病的獨立危險因素，斑塊破裂繼發(fā)血栓形成則直接導致了急性心肌梗塞、急性腦梗、缺血性腦卒中等疾病的發(fā)生［4］。有研究顯示，伐瑞拉地（Varespladib）具有減輕大鼠動脈粥樣硬化損害的作用，但對兔動脈粥樣硬化的作用未見報道。本研究首次觀察Varespladib對兔頸動脈粥樣硬化斑塊的作用，目的是為臨床開發(fā)新型降血脂藥物提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性大白兔20只，平均體重（2.4±0.5）kg，月齡2～3個月，購于鄭州大學實驗動物中心。

1.2 儀器與試劑采用帶UE功能的HITACHI Preirus彩色超聲儀，探頭頻率5～13 MHz。高敏C反應(yīng)蛋白（hs?CRP）、腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL?C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL?C）檢測試劑盒均購自鄭州安塞生物科技有限公司；巨噬細胞CD68檢測試劑盒購自美國Sigma公司；球囊導管（直徑2.5 mm）購自深圳朗醫(yī)科技有限公司；全自動低溫離心機購自上海艾測電子科技有限公司。

1.3 分組及模型制備將20只大白兔用普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機將其分為實驗組和對照組，每組各10只。兩組均采用4F Forgaty球囊導管行頸動脈內(nèi)膜損傷術(shù)。術(shù)后對照組僅給予高脂飼料喂養(yǎng)（1%膽固醇、4%豬油、10%蛋黃粉和85%普通飼料）；試驗組給予高脂飼料的同時還給予Varesp?ladib（30 mg/kg）。

1.4 實驗方法兩組在第18周時均經(jīng)兔耳緣靜脈取血采用酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa試劑盒）檢測hs?CRP、TNF?α和血脂情況（TC、HDL?C、LDL?C），同時兩組均行頸動脈超聲檢查，運動彈性成像技術(shù)［5］對頸動脈斑塊進行評分，將其分為穩(wěn)定斑塊（彈性評分≥3分）和易損斑塊，即不穩(wěn)定斑塊（彈性評分＜3分）。取血后處死動物，分離頸總動脈，并進行固定、包埋、切片和HE染色。每組選取10個高倍鏡視野，運用免疫組織化學染色技術(shù)檢測巨噬細胞CD68的陽性細胞數(shù)表達情況。

1.5 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計軟件應(yīng)用SPSS 17.0，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示，定量資料采用非參數(shù)檢驗，定性資料采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組頸動脈斑塊的超聲檢查結(jié)果試驗組共檢出頸動脈斑塊69個，其中穩(wěn)定斑塊48個，易損斑塊21個；對照組共檢出頸動脈斑塊138個，其中穩(wěn)定斑塊35個，易損斑塊103個，兩組結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義。試驗組斑塊面積占管腔總面積的百分比為（25.07±7.31）%，對照組斑塊面積占管腔總面積的百分比為（39.24±9.52）%。兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。見表1、表2、圖1。

表1 兩組不同類型頸動脈斑塊數(shù)量的比較Tab.1 The number of the two different types of carotid artery plaques in the two groups 個（%）

圖1 頸總動脈斑塊的超聲彈性成像表現(xiàn)Fig.1 The elasticity imaging of the two types of carotid artery plaque

表2 兩組斑塊面積占管腔總面積的百分比Tab.2 The percentage of plaque area in total lumen area±s

表2 兩組斑塊面積占管腔總面積的百分比Tab.2 The percentage of plaque area in total lumen area±s

組別試驗組對照組Z值P值斑塊面積占管腔總面積的百分比（%）25.07±7.31 39.24±9.52 8.842 0.001

2.2 Varespladib對炎癥因子及血脂水平的影響試驗組與對照組血清炎癥因子比較，hs?CRP及TNF?α均降低，其中hs?CRP顯著降低且差異有統(tǒng)計學意義（Z=3.780，P＜ 0.001），而TNF?α僅輕度降低，差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.965，P=0.050）；試驗組與對照組血脂水平比較，TC、HDL?C及LDL?C均有所降低，其中LDL?C降低明顯且差異有統(tǒng)計學意義（Z=3.780，P＜0.001）；而TC和HDL?C僅輕度降低，差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.475，P=0.140；Z=1.361，P=0.173）。見表3。

表3 兩組炎癥因子及血脂水平的比較Tab.3 The level of inflammatory factors and blood lipids in the two groups ±s

表3 兩組炎癥因子及血脂水平的比較Tab.3 The level of inflammatory factors and blood lipids in the two groups ±s

組別試驗組對照組Z值P值hs?CRP（mg/L）5.56±0.41 16.34±0.44 3.780 0.001 TNF?α（mg/L）55.25±0.62 55.98±0.98 1.965 0.050 TC（mmol/L）15.19±0.99 15.91±0.64 1.475 0.140 HDL?C（mmol/L）0.91±0.14 1.05±0.24 1.361 0.173 LDL?C（mmol/L）5.42±0.62 15.71±0.60 3.780 0.001

2.3 正常頸動脈管壁、頸動脈穩(wěn)定斑塊及易損斑塊的病理表現(xiàn)圖2A為正常頸動脈管壁，管壁層次清晰，內(nèi)膜光滑平整；圖2B為穩(wěn)定斑塊，可見凸向管腔的連續(xù)性斑塊，內(nèi)膜中可見泡沫化巨噬細胞和平滑肌細胞；圖2C為易損斑塊，可見內(nèi)膜表面不光滑，不連續(xù)，并有血栓附著。

圖2 正常頸總動脈壁及不同頸動脈斑塊的病理表現(xiàn)（HE，×400）Fig.2 The pathology of normal carotid artery wall and the different types of carotid artery plaque（HE，× 400）

2.4 兩組頸動脈斑塊內(nèi)巨噬細胞CD68的表達情況對照組巨噬細胞CD68的陽性表達數(shù)為（73.50±5.32）個/HP，試驗組巨噬細胞CD68的陽性表達數(shù)為（45.30±4.52）個/HP，試驗組巨噬細胞CD68的陽性表達數(shù)明顯少于對照組（Z=3.785，P＜0.001）。見圖3。

圖3 兩組頸動脈斑塊內(nèi)巨噬細胞CD68的免疫組化結(jié)果（SP，×100）Fig.3 The immunohistochemical effects of CD68 on the macrophages in the two types of carotid artery plaque（SP，×100）

3 討論

動脈粥樣硬化是一種由多因素介導的累及全身多個系統(tǒng)、器官的疾?。?］，動脈粥樣硬化易損斑塊可以形成表面潰瘍、斑塊破裂并繼發(fā)血栓形成，導致急性心、腦血管疾?。?］。磷脂酶A2是一種鈣離子依賴性磷脂酶，被激活后可以促使LDL?C升高，產(chǎn)生大量生物活性物質(zhì)，并通過炎癥因子激活血管壁中的促動脈粥樣硬化通路，形成斑塊［8］。磷脂酶A2中只有可溶性磷脂酶A2能夠促進LDL?C的轉(zhuǎn)移，但幾乎所有的磷脂酶都能夠與LDL?C結(jié)合，形成動脈粥樣硬化微顆粒［8］。因此，抑制磷脂酶的功能對減輕動脈粥樣硬化的程度具有重要的作用。

Verespladib是一種新型的非選擇性磷脂酶A2抑制劑，其對磷脂酶的抑制范圍較廣。Verespladib與傳統(tǒng)的、以降脂為目的的他汀類藥物不同，傳統(tǒng)的他汀類藥物能降低LDL及hs?CRP水平，能夠直接或間接的抑制炎癥反應(yīng)，但對磷脂酶的作用很小。Verespladib作為一種磷脂酶A2抑制劑能夠特異的與磷脂酶A2結(jié)合，抑制其活性，進而抑制由其介導的一系列炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，試驗組中斑塊的檢出數(shù)量明顯少于對照組，且穩(wěn)定斑塊的數(shù)量明顯多于對照組，穩(wěn)定斑塊的彈性分值也高于易損斑塊，說明Verespladib具有顯著的抗動脈粥樣硬化，增強斑塊穩(wěn)定性的作用。這與HURT?CAMEJO等［9］在小鼠身上進行的研究結(jié)果基本一致。本研究中試驗組hs?CRP表達量、LDL?C的含量均顯著低于對照組，這與傳統(tǒng)的他汀類藥物的療效一致，Verespladib通過不同的途徑達到了同樣的效果。巨噬細胞在動脈粥樣硬化的進展中具有重要的作用，活化的巨噬細胞能夠吞噬LDL?C進而形成泡沫細胞，大量泡沫細胞聚集在斑塊的纖維帽中，加上其他脂質(zhì)和細胞使纖維帽的張力增加，厚度變薄，穩(wěn)定性變?nèi)?，容易破裂?0-11］。本研究通過免疫組化技術(shù)檢測巨噬細胞表面的特異性抗原CD68，結(jié)果顯示，試驗組中巨噬細胞CD68的陽性表達量明顯少于對照組，而且試驗組中斑塊面積占管腔總面積的百分比明顯低于對照組，這說明Verespladib可以通過減少動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞的數(shù)量來減小斑塊的面積，抑制斑塊的進展，從而增加斑塊的穩(wěn)定性［12-13］。

綜上所述，Verespladib在抗動脈粥樣硬化及增加易損斑塊穩(wěn)定性的過程中具有重要的作用，雖然國外有研究［14-16］發(fā)現(xiàn)Verespladib能增加心血管事件的發(fā)生率，但基于其顯著的降血脂作用，還需對其進行更深一步的研究，或者考慮聯(lián)合用藥，通過動物實驗和大規(guī)模臨床試驗來驗證其療效。

［1］何文.重視頸動脈斑塊穩(wěn)定性研究［J］.中國醫(yī)學影像技術(shù)，2015，31（5）：643?646.

［2］于明月.超聲彈性成像技術(shù)診斷腦梗死病人的頸動脈斑塊穩(wěn)定性的臨床價值［J］.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2015，14（1）：43?45.

［3］GO A S，MOZAFFARIAN D，ROGER V L，et al.Heart dis?ease and stroke statistics?2014 up date［J］.Circulation，2014，129（3）：399?410.

［4］黃林歡，黃楚明，林麒.動脈粥樣硬化性腦梗死患者二級預防依從性的臨床調(diào)查［J］.實用醫(yī)學雜志，2016，32（13）：2102?2104.

［5］曾林輝.實時超聲彈性成像技術(shù)對頸動脈斑塊穩(wěn)定性的評估效果［J］.中國實用醫(yī)藥，2017，12（33）：49?50.

［6］陳芡茹，葉飛.心血管疾病治療新目標：脂蛋白相關(guān)磷脂酶 A2［J］.心血管病學進展，2016，37（2）：188?192.

［7］王麗紅.阿托伐他汀鈣對血脂正常的老年冠心病患者頸動脈粥樣硬化斑塊的影響［J］.中國社區(qū)醫(yī)師，2017，33（36）：72?73.

［8］陳蕓.超聲檢查在頸動脈粥樣斑塊與腦梗死患者診斷中的應(yīng)用［J］.吉林醫(yī)學，2017，38（12）：2326?2327.

［9］HURT?CAMEIO E，GAUTIER T，ROSENQREN B，et al.Ex?pression of type IIA secretory phospholipase A2 inhibits choles?teryl ester transfer protein activity in transgenic mice［J］.Arte?rioscler Thromb Vasc Biol，2013，33（12）：2707?2714.

［10］吳曉妍，繆緋，王秋實，等.胱抑素C聯(lián)合頸動脈斑塊評分提高胸痛者嚴重冠心病的預測能力［J］.實用醫(yī)學雜志，2017，33（11）：1765?1769.

［11］劉逾前，李海波，張曉慧，等.不穩(wěn)定性頸動脈粥樣硬化斑塊的相關(guān)因素［J］.中國老年學雜志，2017，37（22）：5597?5598.

［12］劉強，宇輝.頸動脈粥樣硬化斑塊及血清炎癥因子與老年腦梗死發(fā)病的相關(guān)性分析［J］.山東醫(yī)藥，2017，57（45）：98?100.

［13］ANA M B，F(xiàn)ERNANDO C，ESTíBALIZ J，et al.Association between the presence of carotid artery plaque and cardiovascu?lar events in patients with genetic hypercholesterolemia［J］.Rev Esp Cardiol（Engl Ed），2017，70（7）：551?558.

［14］TADA H，KAWASHIRI M A，OKADA H，et al.Assessments of carotid artery plaque burden in patients with familial hyper?cholesterolemia［J］.Am J Cardiol，2017，120（11）：1955?1960.

［15］MA?GORZATA W M，DANUTA C，MA?GORZATA K B，et al.Carotid artery plaques?are risk factors the same in men and women with familial hypercholesterolemia？［J］.Int J Cardiol，2017，244（12）：290?295.

［16］MOTOMI T，TORU M，KAZUHIRO O，et al.Measurement of epicardial fat thickness by transthoracic echocardiography for predicting high ?risk coronary artery plaques［J］.Heart Ves?sels，2016，31（11）：1758?1766.