整合素αvβ3拮抗劑HYPOO23對耐藥神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251凋亡的影響

呂帥 王艷林 劉彥廷 蔡宏新 艾文兵

1宜昌市夷陵醫(yī)院（湖北宜昌 443100）；三峽大學(xué) 2醫(yī)學(xué)院，3第一臨床醫(yī)學(xué)院（湖北宜昌 443000）

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤，存在高復(fù)發(fā)率和高病死率的特點。術(shù)前或術(shù)后化療是治療膠質(zhì)瘤，提高患者生存時間的主要方法之一。然而，化療藥物對膠質(zhì)瘤的治療效果不理想；尤其是經(jīng)過多次化療后，化療藥物治療效果明顯比之前差。而膠質(zhì)瘤細胞耐藥是膠質(zhì)瘤化療效果不理想的主要原因之一。因此，提高腫瘤細胞對藥物的敏感性成為提高化療效果的研究熱點。

近來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的耐藥性與整合素密切相關(guān)［1-3］。但整合素拮抗劑能否提高化療藥物對耐藥膠質(zhì)瘤細胞的治療效果，還需深入的研究。本研究通過整合素αvβ3拮抗劑處理耐藥神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞后，觀察神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的凋亡及耐藥蛋白表達量的變化，探討整合素拮抗劑使耐藥神經(jīng)膠質(zhì)瘤對化療藥物的敏感性產(chǎn)生影響及可能的機制，以期為提高化療藥物對耐藥膠質(zhì)瘤的治療效果提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞系：武漢大學(xué)細胞典藏中心；整合素拮抗劑HYP0023：購于Med?chem Express（MCE）公司；替莫唑胺購于圣克魯斯生物技術(shù)公司；Annexin V?FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于Bender Medsystems公司；DMEM高糖培養(yǎng)液（英杰公司）；MGMT、P?gp、MRP和GST（圣克魯斯生物技術(shù)公司）。

1.2 MTT法檢測U251TR細胞的培養(yǎng)及HP0023對U251TR的抑制率本研究使用替莫唑胺溶液濃度遞增［4］的方法，誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞，使其對替莫唑胺產(chǎn)生耐藥，并形成對替莫唑胺具有穩(wěn)定的耐藥性，這樣的耐藥膠質(zhì)瘤細胞株命名為U251TR。誘導(dǎo)的藥物作用濃度梯度為0.25、0.5、1、2、4、16、32 μg/mL。耐藥細胞U251TR培養(yǎng)標(biāo)準［5］：用MTT法檢測U251和U251TR的IC50和耐藥指數(shù)RF。

用不同濃度的整合素拮抗劑HP0023處理人耐藥膠質(zhì)瘤細胞U251TR并通過MTT法測得膠質(zhì)瘤細胞的OD值，計算抑制率。取抑制率小于10%的濃度作為HP0023的后續(xù)試驗濃度。整合素拮抗劑的濃度梯度為：0、0.16、0.32、0.63、1.25、2.5、5、10 μg/mL。

1.3 流式細胞術(shù)Annexin V FITC/PI雙染法測細胞的凋亡將U251TR分為4組，根據(jù)MTT法實驗結(jié)果，分別采用對照試劑、HYPOO23（0.16 μg/mL）、替莫唑胺（32 μg/mL）和 HYPOO23（0.16 μg/mL）+替莫唑胺（32 μg/mL）處理48 h后。按Annexin V FITC/PI雙染法，將細胞用Annexin V?FITC、碘化丙啶染色液，然后進行流式細胞儀檢測，每組測3個樣本。

1.4 Westen blot方法檢測MGMT、P?gp、MRP和GST蛋白取對數(shù)生長期細胞，以1.25×105/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，將耐藥細胞U251TR分為4組，24 h后，分別采用對照試劑、拮抗劑、替莫唑胺和拮抗劑聯(lián)合替莫唑胺處理。48 h后，收集所有細胞，根據(jù)Western blot方法檢測不同的處理方式對U251TR細胞蛋白表達的影響。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件分析。計量資料用表示，采用單因數(shù)方差分析進行組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功培養(yǎng)耐藥膠質(zhì)瘤U251TR細胞本研究使用替莫唑胺溶液濃度遞增的方法，經(jīng)過10個月培養(yǎng)得到耐藥細胞U251TR。U251TR/U251的耐藥指數(shù)RF=8.03±0.46。U251細胞和U251TR細胞的IC50為（4.55± 2.21）μg/mL和（36.54± 5.01）μg/mL，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明成功構(gòu)建了耐藥細胞U251TR。且以32 μg/mL替莫唑胺作為試驗濃度，用不同濃度的HP0023處理人耐藥膠質(zhì)瘤細胞U87TR，通過MTT法測得HP0023濃度為0.16 μg/mL時抑制率為（8.11±2.23）%，以該濃度作為試驗濃度。

2.2 流式細胞術(shù)Annexin V FITC/PI雙染法測細胞的凋亡對照試劑早期凋亡率為（1.8±0.9）%，晚期凋亡率為（3.4±0.8）%；拮抗劑早期凋亡率為（3.8±1.0）%，晚期凋亡率為（3.1±0.9）%；替莫唑胺早期凋亡率為（2.6±1.0）%，晚期凋亡率為（2.2±0.7）%；拮抗劑聯(lián)合替莫唑胺處理早期凋亡率為（10±1.2）%，晚期凋亡率為（8.5±0.9）%。拮抗劑聯(lián)合替莫唑胺處理組與其他3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 流式細胞術(shù)Annexin V FITC/PI雙染法測各組U251TR細胞凋亡Fig.1 Flow cytometry Annexin V FITC/PI double staining test groups U251TR cell apoptosis

2.3 Western blot檢測耐藥蛋白表達水平4個實驗組 Western blot檢測細胞 MGMT、P?gp、MRP 和GST蛋白表達（圖2）顯示，與對照組和替莫唑胺組相比，HYPOO23組和HYPOO23+替莫唑胺組的MGMT和P?gp蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MRP和GST蛋白表達水平未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 不同處理方式對MGMT、P?gp、MRP和GST蛋白表達水平的影響Fig.2 The impact of MGMT，P?gp，MRP and GST protein expression level by different processing methods

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞耐藥與P?糖蛋白（P?gly?eoprote，P?gp）［5-6］、多藥耐藥相關(guān)蛋（multi?drug re?sistance related protein，MRP）［7］、O6 甲基鳥嘌呤DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O6?methyl?guanine?DNA ?methyl?transferase［8］，MGMT）、谷胱甘肽/谷胱甘肽?S轉(zhuǎn)移酶（GSH/GSTS）［9］等多種耐藥機制有關(guān)。然而，近來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的耐藥性與整合素密切相關(guān)［1-3］。但整合素拮抗劑與耐藥膠質(zhì)瘤細胞的治療效果相關(guān)關(guān)系還需深入的研究。

整合素是存在于細胞膜表面，由α亞基和β亞基構(gòu)成的二聚體，含有細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜α螺旋和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域［10-11］。在課題組前期的研究［12-13］中發(fā)現(xiàn)，其參與腫瘤的多種惡性生物學(xué)行為，如腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等。本研究通過整合素αvβ3拮抗劑HYP0023與替莫唑胺分別或聯(lián)合處理耐藥的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞后，觀察神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，結(jié)果顯示經(jīng)HYP0023聯(lián)合替莫唑胺處理的耐藥膠質(zhì)瘤細胞的凋亡率比其他3組高；證實阻滯整合素向細胞內(nèi)傳導(dǎo)信號，可提耐藥膠質(zhì)瘤腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，且HYP0023可以提高化療藥的治療效果。這與HSIEH等［14］阻滯整合素向細胞內(nèi)傳導(dǎo)信號，提高急性淋巴細胞白血病的腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［13］的實驗結(jié)果相一致。

本研究結(jié)果還顯示，拮抗劑HYPOO23組和HYPOO23+替莫唑胺組的MGMT和P?gp蛋白表達水平降低，而MRP和GST蛋白蛋白表達水平未見明顯變化。GAO等［15］發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR?370?3p影響MGMT表達量，可以提高多形性成膠質(zhì)細胞瘤的替莫唑胺化療敏感性。因此，有理由相信，MGMT和P?gp蛋白參與整合素拮抗劑提高耐藥膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性和促進凋亡的現(xiàn)象。類似的實驗結(jié)果還未見相關(guān)的報道，且具體的作用機制及信號傳導(dǎo)途徑有待進一步研究。

綜上所述，整合素拮抗劑HYP0023可以調(diào)節(jié)耐藥膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性，促進凋亡；并且這現(xiàn)象與MGMT和P?gp表達下降有關(guān)。但這個現(xiàn)象，還需進一步的動物實驗來驗證。本課題也為臨床克服膠質(zhì)瘤患者化療耐藥提供了一個新思路。

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