雌激素對(duì)人乳頭狀瘤病毒16型E6基因轉(zhuǎn)染人永生化表皮細(xì)胞效率的影響

盧曉聲，陳菁，趙軍招，呂杰強(qiáng)

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 生殖中心，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一種嗜上皮病毒，可導(dǎo)致人類(lèi)皮膚和黏膜病變[1]。盡管HPV型別眾多，但流行病學(xué)研究表明HPV 16感染為全球?qū)m頸癌致病主要型別[2]。HPV早期癌蛋白E6在宮頸上皮細(xì)胞癌變過(guò)程中起著重要作用。有研究認(rèn)為宮頸癌是一種激素依賴性的疾病，雌激素在HPV致癌的過(guò)程中有協(xié)同作用[3]。但是，雌激素水平的升高是否與HPV感染有關(guān)目前尚存在爭(zhēng)議。本研究采用不同濃度的雌二醇（17-β-E2，E2）作用于單層培養(yǎng)的人類(lèi)永生化表皮細(xì)胞系HaCat，向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染HPV 16型的主要致癌基因E6，模擬HPV感染人類(lèi)上皮細(xì)胞的生物過(guò)程，探討雌激素對(duì)宿主細(xì)胞感染HPV的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒 HaCaT細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)），以10% FBS+1%青霉素/鏈霉素雙抗+高糖型DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），于37 ℃，5% CO2，飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，7 d 1∶3傳代；含HPV l6 E6的真核表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器 E2購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；D6922-01質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)OMEGA生物技術(shù)公司；Lipofectione 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)MBI Fermentas公司；APO-BRDU?試劑盒購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制（細(xì)胞計(jì)數(shù)法）：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCat細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為10000個(gè)/孔接種于24孔板。細(xì)胞貼壁后，分別采用含有10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，0 mol/L的E2培養(yǎng)液培養(yǎng)，每48 h換液1次。每24 h取不同濃度的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（3次/孔并取均值），共計(jì)數(shù)7 d。

1.3.2 細(xì)胞活性測(cè)定（MTT法）：制備細(xì)胞懸液，以2000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中。細(xì)胞貼壁后分7組，分別加入含10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，0 mol/L（對(duì)照組）的E2的培養(yǎng)基以及PBS液（Control）200 μL。在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h三個(gè)節(jié)點(diǎn)，采用MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇波長(zhǎng)490 nm檢測(cè)吸光度（A）。

1.3.3 細(xì)胞周期分布檢測(cè)：取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期HaCaT細(xì)胞制備懸液，以2×105個(gè)細(xì)胞/孔布6孔板，細(xì)胞貼壁后用含10-5，10-6，10-7，10-8，10-9， 0 mol/L的E2的培養(yǎng)基以及PBS 3 mL培養(yǎng)72 h。再加入終濃度0.01 mmol的5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU），按照BrdU試劑盒步驟操作并上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.4 細(xì)胞周期時(shí)相檢測(cè)：制備細(xì)胞懸液，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使最終濃度為10 μg/mL。44 h加秋水仙素，使終濃度為0.1 μg/mL。48 h后消化細(xì)胞染色體制片。鏡檢100個(gè)分裂相，計(jì)第1、2、3、4細(xì)胞期分裂指數(shù)。細(xì)胞周期（Tc）=48/[（M1+2M2+3M3+4M4）/100]（h）。

1.3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：使用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞將含HPV 16 E6的質(zhì)粒擴(kuò)增，按質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。將HaCat細(xì)胞以5×105個(gè)/皿接種，貼壁后以含有10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，0 mol/L的E2培養(yǎng)基培養(yǎng)。在細(xì)胞生長(zhǎng)豐度達(dá)到80%時(shí)開(kāi)始按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明轉(zhuǎn)染。

1.3.6 Real-time PCR：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取RNA，按照Real-time PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作并上機(jī)測(cè)定RNA。HPV 16 E6引物序列（由大連TAKARA有限公司合成）如下：上游：5’-GCGACCCAGAAAGTTACCACA-3’，下游：5’-GCATAAA TCCCGAAAAGCAAAG-3’。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。正態(tài)分布計(jì)量資料用±s表示，各組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度E2作用下HaCat細(xì)胞生長(zhǎng)情況 在無(wú)E2作用時(shí)，HaCat細(xì)胞的倍增時(shí)間約為24 h。而經(jīng)過(guò)10-7～10-5mol/L的E2作用細(xì)胞倍增時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，低濃度（10-9～10-8mol/L）E2對(duì)HaCat細(xì)胞增長(zhǎng)的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度E2作用下HaCat細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.2 不同濃度E2作用下HaCat細(xì)胞活性情況 當(dāng)E2濃度在10-7～10-5mol/L范圍時(shí)，HaCat細(xì)胞活性與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)濃度為10-9～10-8mol/L時(shí)，細(xì)胞活性與對(duì)照組比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度E2作用下不同時(shí)間點(diǎn)HaCat細(xì)胞的細(xì)胞活性測(cè)定

2.3 不同濃度E2作用下HaCat細(xì)胞周期分布 各組細(xì)胞均以G1期的細(xì)胞為主，S期次之，G2期最少，提示E2不改變HaCat細(xì)胞的周期時(shí)項(xiàng)的比例。見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度E2作用下HaCat細(xì)胞周期分布的變化

2.4 不同濃度E2作用下HaCat細(xì)胞時(shí)相變化 對(duì)照組HaCat細(xì)胞的平均細(xì)胞周期是（18.21±1.09）h。在E2濃度為10-7～10-5mol/L的范圍內(nèi)細(xì)胞周期比對(duì)照組短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 不同濃度E2作用下HaCat細(xì)胞周期時(shí)相的變化

2.5 不同濃度E2作用下HaCat細(xì)胞轉(zhuǎn)染HPV 16 E6的mRNA表達(dá)情況 與對(duì)照組比，在10-7～10-5mol/L的E2作用下，轉(zhuǎn)染HPV 16 E6基因后的HaCat細(xì)胞內(nèi)E6 mRNA表達(dá)增高（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度E2作用下HaCat細(xì)胞轉(zhuǎn)染HPV 16 E6的mRNA表達(dá)

3 討論

臨床上HPV感染受到性伴侶、性觀念、生育、性傳播疾病、吸煙等多種因素影響，使流行病學(xué)調(diào)查對(duì)外源性雌激素的接觸很難進(jìn)行獨(dú)立的分析，因此許多調(diào)查會(huì)得出不同的結(jié)論。

有研究認(rèn)為口服避孕藥是HPV感染的危險(xiǎn)因素[4-5]；一項(xiàng)追蹤了9年的隊(duì)列研究顯示：服用避孕藥超過(guò)15年的女性，罹患宮頸癌及癌前病變的相對(duì)危險(xiǎn)度分別達(dá)到1.8和1.6[6]。然而也有大樣本病例對(duì)照研究表明口服避孕藥與HPV感染無(wú)明顯關(guān)系。2006年的一項(xiàng)隊(duì)列研究認(rèn)為，口服避孕藥的長(zhǎng)期使用（10年）并不增加HPV感染的風(fēng)險(xiǎn)，但可能使HPV持續(xù)性感染的細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化[7]。另一項(xiàng)隊(duì)列研究也指出：長(zhǎng)期口服性激素沒(méi)有增加HPV相關(guān)的惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)[8]，采用口服避孕藥和使用宮內(nèi)節(jié)育器進(jìn)行避孕的2組女性之間的HPV感染率也并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[9]。

較多組織學(xué)、病理學(xué)上的研究則支持性激素與HPV感染有關(guān)。既往文獻(xiàn)通過(guò)檢測(cè)正常宮頸上皮、非典型增生及宮頸癌組織中雌激素受體（estrogen receptor，ER）及HPV的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ER陽(yáng)性患者更易發(fā)生HPV感染[10]。也有研究顯示雌、孕激素可增強(qiáng)HPV 16癌基因E6和E7的轉(zhuǎn)錄活性[11]。最有力的證據(jù)來(lái)自于HPV 16 E6/E7轉(zhuǎn)基因小鼠，它們?cè)谂咛r(shí)期就開(kāi)始表達(dá)HPV 16 E6/E7基因，但很少自發(fā)宮頸癌。在使用E2干預(yù)6周后，這些小鼠均出現(xiàn)了宮頸癌[12]。

本研究將單層體外培養(yǎng)的細(xì)胞加以E2的刺激，觀察其對(duì)HPV 16 E6基因轉(zhuǎn)染影響，發(fā)現(xiàn)一定濃度的外源性雌激素可使宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)加速，活性增加，轉(zhuǎn)染后HPV 16 E6的表達(dá)也相應(yīng)增加。表明雌激素水平的升高可能會(huì)增加HPV感染的風(fēng)險(xiǎn)。

HPV E6蛋白會(huì)與抑癌基因p53結(jié)合，使之降解，導(dǎo)致細(xì)胞周期的調(diào)控失常而誘使惡性腫瘤的發(fā)生[13]。細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1是細(xì)胞周期G1/S期的關(guān)鍵調(diào)控因子[14]。雌激素可上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。本研究中，雌激素促進(jìn)HaCat細(xì)胞的增殖，使其細(xì)胞周期縮短，與雌激素對(duì)細(xì)胞周期的正性調(diào)控因子的促進(jìn)作用相符。但雌激素并沒(méi)有改變?cè)摷?xì)胞細(xì)胞周期的時(shí)相，其作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

HPV只能感染復(fù)層上皮的基底層細(xì)胞，而無(wú)法感染分化終末期的細(xì)胞，提示HPV感染與宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期有關(guān)[16]。PYEON等[17]的研究發(fā)現(xiàn)：宿主細(xì)胞必須進(jìn)入M期才能啟動(dòng)HPV衣殼基因的轉(zhuǎn)錄。本研究中，將HaCat細(xì)胞暴露在一定濃度范圍內(nèi)的E2中，HaCat細(xì)胞的數(shù)目和活性增加，證明E2具有促進(jìn)靶細(xì)胞增殖的能力。當(dāng)細(xì)胞周期的進(jìn)程縮短，數(shù)目增加，進(jìn)入M期的細(xì)胞數(shù)目增多，活性增強(qiáng)，則受到HPV感染的幾率也就越大。因此E2作用后HaCat細(xì)胞轉(zhuǎn)染HPV 16 E6的效率會(huì)隨著E2濃度的升高而增加。

雌激素還可通過(guò)調(diào)整多種炎癥因子和抗原遞呈復(fù)合物的表達(dá)，促使G1期的細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)病灶的增殖[18]。雌激素對(duì)HPV 16 E6整合進(jìn)入宿主DNA的過(guò)程是否也存在著對(duì)炎癥因子的調(diào)節(jié)有待進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：

[1] GOODMAN A. HPV testing as a screen for cervical cancer[J]. BMJ, 2015, 350: h2372.

[2] 侯柏龍, 杜王琪, 熊一融, 等. 人宮頸癌SiHa細(xì)胞荷瘤裸鼠模型的建立及鑒定[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 46(2): 92-96.

[3] RINALDI S. PLUMMER M, BIESSY C, et al. Endogenous sex steroids and risk of cervical carcinoma: results from the EPIC study[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2011, 20(12): 2532-2540.

[4] LUHN P, WALKER J, SCHIFFMAN M, et al. The role of co-factors in the progression from human papillomavirus infection to cervical cancer[J]. Gynecol Oncol, 2013, 128(2):265-270.

[5] SALAZAR E L, GONZALEZ J L, OLMOS A, et al. Influence of the use of oral contraceptives as risk factors for human papillomavirus infection and cervical intraepithelial neoplasia[J]. Ginecol Obstet Mex, 2005, 73(2): 83-89.

[6] ROURA E, TRAVIER N, WATERBOER T, et al. The influence of hormonal factors on the risk of developing cervical cancer and pre-cancer: results from the EPIC cohort[J].PLoS One, 2016, 11(1): e0147029.

[7] VACCARELLA S, HERRERO R, DAI M, et al. Reproductive factors, oral contraceptive use, and human papillomavirus infection: pooled analysis of the IARC HPV prevalence surveys[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2006,15(11): 2148-2153.

[8] LONGATTO-FILHO A, HAMMES L S, SARIAN L O, et al.Hormonal contraceptives and the length of their use are not independent risk factors for high-risk HPV infections or high-grade CIN[J]. Gynecol Obstet Invest, 2011, 71(2): 93-103.

[9] GAVRIC-LOVREC V, TAKAC I. Use of various contraceptives and human papillomavirus 16 and 18 infections in women with cervical intraepithelial neoplasia[J]. Int J STD AIDS, 2010, 21(6): 424-427.

[10] SON J, PARK J W, LAMBERT P F, et al. Requirement of estrogen receptor alpha DNA-binding domain for HPV oncogene-induced cervical carcinogenesis in mice[J]. Carcinogenesis, 2013, 35(2): 489-496.

[11] GARCIA C, HERNANDEZ-GARCIA D, VALENCIA C,et al. E6/E7 oncogenes in epithelial suprabasal layers and estradiol promote cervical growth and ear regeneration[J]. Oncogenesis, 2017, 6(8): e374.

[12] CHUNG S H, SHIN M K, KORACH K S, et al. Requirement for stromal estrogen receptor alpha in cervical neoplasia[J]. Horm Cancer, 2013, 4(1): 50-59.

[13] MARTINEZ-ZAPIEN D, RUIZ F X, POIRSON J, et al.Structure of the E6/E6AP/p53 complex required for HPV-mediated degradation of p53[J]. Nature, 2016, 529(7587):541-545.

[14] INOUE K, FRY E A. Aberrant expression of Cyclin D1 in cancer[J]. Sign Transduct Insights, 2015, 4: 1-13.

[15] AHLIN C, LUNDGREN C, EMBRETSEN-VARRO E, et al. High expression of cyclin D1 is associated to high proliferation rate and increased risk of mortality in women with ER-positive but not in ER-negative breast cancers[J]. Breast Cancer Res Treat, 2017, 164(3): 667-678.

[16] GRIFFIN L M, CICCHINI L, XU T, et al. Human keratinocyte cultures in the investigation of early steps of human papillomavirus infection[J]. Methods Mol Biol, 2014, 1195:219-238.

[17] PYEON D, PEARCE S M, LANK S M, et al. Establishment of human papillomavirus infection requires cell cycle progression[J]. PLoS Pathog, 2009, 5(2): e1000318.

[18] MORA-GARCIA M L, áVILA-IBARRA L R, GARCIAROCHA R, et al. Cervical cancer cells suppress effector functions of cytotoxic T cells through the adenosinergic pathway[J]. Cell Immunol, 2017, 320: 46-55.