少精子癥患者精子魚精蛋白表達(dá)及染色質(zhì)包裝質(zhì)量

洪丹，樓哲豐，鄭九嘉，黃學(xué)鋒，金龍金

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，檢驗醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點實驗室，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325015）

全球有近15%的不孕不育夫婦，男性因素約占50%[1]，其中男性不育患者中有14%～15%伴有精子數(shù)量或質(zhì)量異常[2]。魚精蛋白作為成熟精子中主要的核蛋白，包括魚精蛋白1和魚精蛋白2家族，分別由PRM1和PRM2編碼[3]，其轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾均涉及復(fù)雜的調(diào)控機制[4-5]，與精子形成、精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常、男性不育密切相關(guān)[6-7]。TBP相關(guān)因子2（TBP related factor 2，TRF2）是哺乳動物睪丸組織中特異性表達(dá)的調(diào)控因子，對精子形成過程中某些特異性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起關(guān)鍵作用[8]。本研究通過檢測PRM1、PRM2、TRF2的表達(dá)以及精子染色質(zhì)包裝質(zhì)量，探討成熟精子中轉(zhuǎn)錄因子TRF2、魚精蛋白和染色質(zhì)包裝質(zhì)量與少精子癥的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 對象 28例少精子癥患者、16例畸形精子癥患者和15例正常對照者標(biāo)本來自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖中心。所有標(biāo)本在采集前禁欲3～5 d，采集后在37 ℃、20～30 min完全液化，采用計算機輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）分析和改良巴氏染色法，按WHO（第五版）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。此外，入選的所有標(biāo)本經(jīng)鏡檢驗證無圓細(xì)胞及白細(xì)胞污染，同時均需符合：無生殖系統(tǒng)感染、無內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)疾病、無隱睪和精索靜脈曲張、抗精子抗體陰性。所有標(biāo)本來源經(jīng)本人知情同意并簽署知情同意書。收集的標(biāo)本分裝后用于后續(xù)各項實驗。

1.2 主要試劑 Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購自日本Takara公司，色霉素A3（chromomycin A3，CMA3）染料購自美國Sigma公司，DEPC水購自上海生工生物工程股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 精子純化：精液標(biāo)本離心后棄上清，PBS吹打混勻，離心，棄上清；重復(fù)2～3次。

1.3.2 精子RNA提?。褐貞壹兓玫木映恋?，加入Trizol，混勻后靜置；加入氯仿混勻后靜置再離心；吸取上層水相后加入等體積的異丙醇，混勻靜置后離心；棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀，混勻后離心，棄上清，重復(fù)1次；沉淀干燥至半透明，用DEPC水溶解；檢測RNA濃度、純度及完整性。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：配置反應(yīng)體系，37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s反應(yīng)，產(chǎn)物作為后續(xù)實驗的模板。

1.3.4 qPCR：通過Primer bank搜索或Primer Premier5.0軟件設(shè)計目的基因引物，使用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對后，交由華大基因公司合成。引物序列（5’→3’）如下：PRM1 F：CAGCCCACAGAGTTCCA CCT，R：GCACCTCATGGCTCTCCTC；PRM2 F：GCAAGAGC AAGGACACCAC，R：AGCCTCTGCGATGCCTCCT；TRF2 F：AACAACAAAGCAAGGAAGACGGAGT，R：AAGGAGAAGCTGGA GGACAAGGAT；GAPDH F：GCCAGTGGACTCCACGAC，R：CAACTACATGGTTTACATGTTC。配置反應(yīng)體系，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、循環(huán)40次。

1.3.5 CMA3染色：配置CMA3染料，純化的精子沉淀調(diào)成40×106/mL的精子懸液混勻后均勻地涂在潔凈的載玻片上；干燥后固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）中固定10 min；PBS反復(fù)沖洗，干燥后加50 μL CMA3染料均勻覆蓋涂片，避光染色20 min；PBS反復(fù)沖洗，干燥后普通熒光顯微鏡觀察。以發(fā)出明亮黃色熒光的精子為陽性，暗淡熒光或是無熒光的為陰性。每例標(biāo)本至少計數(shù)200個精子，CMA3陽性率=陽性精子數(shù)/（陽性精子數(shù)+陰性精子數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本資料 少精子癥組平均年齡為（30.36±0.97）歲，畸形精子癥組為（32.50±1.28）歲，正常對照組為（30.00±1.07）歲。各組精液參數(shù)見表1。

表1 少精子癥組、畸形精子癥組和正常對照組精液參數(shù)（±s）

表1 少精子癥組、畸形精子癥組和正常對照組精液參數(shù)（±s）

2.2 qPCR結(jié)果 以GAPDH為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCq法分別計算3組PRM1、PRM2和TRF2 mRNA相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示，少精子癥組PRM1和PRM2 mRNA相對表達(dá)量分別為正常對照組的25%（P＜0.05）和20%（P＜0.05）；畸形精子癥組PRM1和PRM2 mRNA相對表達(dá)量分別為正常對照組的66%和69%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1A-B。與正常對照組相比，少精子癥組和畸形精子癥組TRF2 mRNA相對表達(dá)量分別為正常對照組的128%和119%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1C。

2.3 CMA3染色結(jié)果與陽性率計算 CMA3染色結(jié)果顯示少精子癥組CMA3陽性率為（20.47±1.19）%，畸形精子癥組為（14.31±2.01）%，正常對照組為（10.69±1.45）%；少精子癥組陽性率是正常對照組的191%（P＜0.001）；畸形精子癥組陽性率是正常對照組的134%（P＞0.05）。見圖2。

圖1 3組PRM1、PRM2和TRF2 mRNA相對表達(dá)量比較

3 討論

超過一半的男性不育患者病因尚不明確，先天或后天因素都能導(dǎo)致不育的發(fā)生。輔助生殖技術(shù)尤其是胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)，已能幫助部分由男性因素引起不育的夫婦獲得子代[9-10]。然而該技術(shù)可能逃避受精過程中對潛在具有遺傳缺陷的異常精子的自然選擇機制，沒有對潛在的遺傳缺陷進(jìn)行全面的篩查，因此有必要深入研究精子功能。

精子質(zhì)量低下是造成精子功能異常和男性不育的重要原因。研究表明，前來就診的男性不育患者中約有30%為不明原因的少精子癥或無精子癥[11]，由于本研究收集的精液標(biāo)本中少精子癥常伴隨畸形精子癥，因此本研究分別檢測少精子癥組、畸形精子癥組和正常對照組中魚精蛋白表達(dá)情況并初步探討其中可能的發(fā)生機制。

精子發(fā)生包括精原細(xì)胞的有絲分裂、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精子形成。精子形成的特征性事件之一是核蛋白組型轉(zhuǎn)換，與核DNA結(jié)合的組蛋白被過渡蛋白取代，最終被睪丸特異性的魚精蛋白取代，這一過程能夠使細(xì)胞核濃縮形成精子特殊的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而保證遺傳信息的傳遞[12]。研究表明，魚精蛋白2表達(dá)水平降低導(dǎo)致的雄性小鼠不育與PRM1和PRM2突變有關(guān)，二者任一等位基因突變都會導(dǎo)致單倍型的缺乏[13]。本研究針對魚精蛋白（PRM1和PRM2）轉(zhuǎn)錄水平的研究發(fā)現(xiàn)，少精子癥組中PRM1和PRM2 mRNA相對表達(dá)量分別為正常對照組的25%與20%，表達(dá)顯著降低；而畸形精子癥組則無統(tǒng)計學(xué)差異。提示PRM1和PRM2 mRNA表達(dá)量減少可能是成熟精子數(shù)量減少而非成熟精子形態(tài)異常的原因。

圖2 CMA3染色結(jié)果及陽性率比較（×400）

那么魚精蛋白表達(dá)異常是如何影響下游水平，又是如何受到上游調(diào)控，從而使得成熟精子數(shù)量減少？一方面，魚精蛋白對于精子核結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和核染色質(zhì)的濃集具有重要作用[14]。本研究通過CMA3染色檢測精子染色質(zhì)包裝質(zhì)量，評估精子內(nèi)魚精蛋白的表達(dá)水平[15]，發(fā)現(xiàn)少精子癥組中CMA3陽性率顯著高于正常對照組，畸形精子癥組與正常對照組之間則無統(tǒng)計學(xué)差異，說明染色質(zhì)包裝異常可能是成熟精子數(shù)量減少而非成熟精子形態(tài)異常的原因。魚精蛋白是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)成分之一，其表達(dá)減少使得核蛋白與DNA親和力降低，從而影響DNA-魚精蛋白復(fù)合體的形成；更有研究表明，PRM2敲除小鼠精子細(xì)胞染色質(zhì)濃縮不全、DNA損傷加劇，即使通過胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)都無法生育[16]。結(jié)合本研究結(jié)果提示，魚精蛋白表達(dá)減少可能是通過影響精子染色質(zhì)包裝結(jié)構(gòu)，使得精子形成過程異常，而這可能是成熟精子數(shù)量減少的原因。另一方面，精子形成中（除基本轉(zhuǎn)錄因子之外）許多睪丸特異性的轉(zhuǎn)錄因子和一些基本轉(zhuǎn)錄因子的特異轉(zhuǎn)錄本形式，或通過調(diào)節(jié)PRMs轉(zhuǎn)錄活性，或在轉(zhuǎn)錄后修飾等方面發(fā)揮重要作用[17-18]。睪丸特異性調(diào)控因子TRF2能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 IIA和TF IIB形成大分子蛋白復(fù)合體，抑制RNA聚合酶 II的轉(zhuǎn)錄[19]。我們的結(jié)果顯示，少精子癥組與正常對照組、畸形精子癥組與正常對照組的TRF2 mRNA表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)差異。MARTIANOV等[20]對基因敲除小鼠的研究顯示，單倍體精子中TRF2 mRNA表達(dá)有2個高峰期：圓形精子細(xì)胞和延長形精子細(xì)胞。本研究檢測到成熟精子中TRF2 mRNA表達(dá)量明顯低于PRM1和PRM2 mRNA的含量，提示在成熟精子中對TRF2的檢測可能沒有實際意義。

綜上所述，魚精蛋白（PRM1和PRM2）mRNA表達(dá)量減少，可能影響精子染色質(zhì)包裝，使得精子形成過程異常，這可能是成熟精子數(shù)量減少的原因。成熟精子中TRF2 mRNA表達(dá)量較低，可能與其僅在精子形成過程早期表達(dá)有關(guān)，可通過檢測生精細(xì)胞中TRF2以及其他階段特異性表達(dá)基因[21]表達(dá)，研究其與少精子癥、魚精蛋白的相關(guān)性，從而進(jìn)一步探討調(diào)控魚精蛋白表達(dá)的相關(guān)機制。

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