丹酚酸A對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬和細(xì)胞損傷的影響

李偉文，藍(lán)秀，黎媛，孫蕾，呂祝慶

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 麗水 323000）

人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMVECs）是構(gòu)成肺泡-毛細(xì)血管屏障的重要成分。在肺炎癥性疾病中，內(nèi)毒素誘導(dǎo)的HPMVECs損傷是導(dǎo)致肺泡-毛細(xì)血管屏障破壞，最終導(dǎo)致急性肺損傷，甚至導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征的重要原因之一[1-2]，預(yù)防和治療HPMVECs損傷是降低患者病死率的重要手段[2-3]。丹酚酸A（salvi-anolic acid A，Sal A）是從丹參根莖中提取的重要活性成分，具有清除氧自由基、降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、減少細(xì)胞損傷的作用[4-5]。本研究以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）作為誘導(dǎo)劑，構(gòu)建HPMVECs損傷模型，觀察Sal A對(duì)LPS誘導(dǎo)的HPMVECs損傷的保護(hù)作用，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 HPMVECs購(gòu)于美國(guó)ScienCell公司，Sal A、MTT、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，10%胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，ROS檢測(cè)試劑盒和JC1試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，線粒體蛋白提取試劑盒購(gòu)于上海貝博生物科技有限公司，Beclin1、LC3 II/I、PINK1、Parkin和Tubulin單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：HPMVECs用含鏈霉素、氯霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基傳代，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞融合達(dá)80%以上時(shí)傳代，取第4～第8代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)：按照文獻(xiàn)[6]方法，以細(xì)胞密度為2×104/mL接種于96孔板，每孔200 μL，次日換無(wú)血清培養(yǎng)基。用0.5、2.5、5、10、25、50 μmol/L Sal A處理48 h；分為4組：對(duì)照組、Sal A組、LPS組、LPS+Sal A組，Sal A組用終濃度為50 μmol/L的Sal A處理，LPS組用終濃度為10 μg/mL LPS處理，LPS+Sal A組用10 μg/mL的LPS和50 μmol/L的Sal A共培養(yǎng)，對(duì)照組不加藥，并設(shè)置空白對(duì)照為調(diào)零孔，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。經(jīng)上述處理后，每孔加入20 μL MTT試劑，加入二甲基亞砜后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔的吸光度值（A值）。細(xì)胞相對(duì)存活率=（受試組A值-空白對(duì)照A值）/（對(duì)照組A值-空白對(duì)照A值）×100%。

1.2.3 ROS相對(duì)含量和線粒體膜電位檢測(cè)：按上述分組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按照ROS試劑盒檢測(cè)方法，用終濃度為10 μmol/L的DCFH-CA重懸細(xì)胞，置入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，以無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次后，用流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)ROS含量改變。按照J(rèn)C1試劑盒說(shuō)明書操作方法收集1×106個(gè)細(xì)胞，用JC1染色緩沖液洗滌2次，加入10 μg/mL的JC1試劑，置入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光強(qiáng)度改變。以對(duì)照物為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各組ROS和JC1的相對(duì)含量。

1.2.4 蛋白提取及濃度測(cè)定：按上述分組繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄上清，用預(yù)冷PBS漂洗2次，加入120～150 μL RIPA裂解液冰上裂解10～15 min，4 ℃離心機(jī)12000 r/min離心15 min，取上清，即為細(xì)胞總蛋白。根據(jù)線粒體提取試劑盒說(shuō)明書，將各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，加入200 μL試劑A，冰上靜置10 min，勻漿后，離心，取上清液，11000×g離心后，棄上清，加入試劑B，再次離心后，取沉淀物，加入100 μL的裂解液，收集線粒體蛋白。采用BCA法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白和線粒體蛋白濃度。

1.2.5 免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞及線粒體自噬蛋白改變：取20 μg細(xì)胞總蛋白或者線粒體蛋白4%～12%聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，3%脫脂牛奶室溫封閉30～60 min。加入一抗（Beclin1、LC3 II/I、PINK1、Parkin和Tubulin），4 ℃孵育過(guò)夜；PBST緩沖液洗滌3次，每次8～10 min，加入HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1～2 h，PBST緩沖液洗膜3次，每次8～10 min，用ECL試劑發(fā)光、顯影和定影，Image J軟件進(jìn)行蛋白顯帶顏色深淺和面積計(jì)算，以Tubulin為內(nèi)參。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量資料方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 Sal A對(duì)HPMVECs相對(duì)存活率的影響

圖2 Sal A對(duì)LPS誘導(dǎo)HPMVECs損傷的影響

2.1 Sal A抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷作用 圖1顯示以終濃度為0.5、2.5、5、10、25、50 μmol/L的Sal A處理HPMVECs 48 h后，細(xì)胞增殖無(wú)顯著抑制，與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。圖2顯示，50 μmol/L Sal A處理24 h、48 h和72 h后，細(xì)胞相對(duì)存活率無(wú)明顯降低，與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。10 μg/mL LPS處理24 h、48 h和72 h后，細(xì)胞相對(duì)存活率降低；與LPS組比，LPS+Sal A組24 h、48 h和72 h時(shí)細(xì)胞相對(duì)存活率顯著增高（P＜0.05），但低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 Sal A對(duì)LPS誘導(dǎo)HPMVECs的ROS含量和線粒體膜電位的影響 ROS活性檢測(cè)結(jié)果顯示：LPS組較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05），Sal A組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），LPS+Sal A組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但低于LPS組（P＜0.05）。線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果顯示：LPS組較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），Sal A組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），LPS+Sal A組顯著低于對(duì)照組，高于LPS組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 Sal A調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)線粒體自噬水平 細(xì)胞自噬蛋白檢測(cè)結(jié)果：Sal A組LC3- II/I、Beclin1、PINK1和Parkin相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），LPS組LC3- II/I、Beclin1、PINK1和Parkin蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均顯著增高（P＜0.05），LPS+Sal A組LC3- II/I、Beclin1、PINK1和Parkin蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但低于LPS組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。線粒體自噬蛋白檢測(cè)結(jié)果：Sal A組PINK1和Parkin相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），LPS組PINK1和Parkin蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比均顯著增高（P＜0.05）；LPS+Sal A組PINK1和Parkin蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但低于LPS組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表1 各組ROS含量和線粒體膜電位比較（n=3，±s）

表1 各組ROS含量和線粒體膜電位比較（n=3，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05；與LPS組比：bP＜0.05

3 討論

LPS誘導(dǎo)的HPMVECs炎性損傷模型是目前常用的體外模擬肺泡-毛細(xì)血管屏障損害模型[2]。本研究以該模型作為工具，分析Sal A對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，10 μg/mL LPS處理HPMVECs 24 h后，細(xì)胞相對(duì)存活率顯著降低，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞相對(duì)存活率逐漸下降，說(shuō)明10 μg/mL LPS成功構(gòu)建細(xì)胞損傷模型；終濃度為0.5、2.5、5、10、25、50 μmol/L的Sal A對(duì)HPMVECs無(wú)顯著抑制作用。以終濃度為50 μmol/L的Sal A與LPS共同處理HPMVECs后，細(xì)胞相對(duì)存活率較LPS組顯著增加，說(shuō)明Sal A具有抑制LPS誘導(dǎo)HPMVECs損傷作用。

線粒體是機(jī)體能量代謝的中心，是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源之一[7]。適量的ROS有利于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)的啟動(dòng)，促進(jìn)增殖和分化，但過(guò)量ROS誘發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體功能異常、細(xì)胞損傷、凋亡[8-9]。有學(xué)者認(rèn)為線粒體損傷初期通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)途徑，誘發(fā)ROS爆發(fā)性增高，導(dǎo)致線粒體膜電位改變；靶向性降低細(xì)胞內(nèi)ROS，可顯著抑制線粒體功能異常[9-10]。本研究中，10 μg/mL LPS處理HPMVECs 48 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著增高，線粒體膜電位顯著降低，提示LPS誘導(dǎo)線粒體損傷。50 μmol/L的Sal A顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS含量增高和線粒體膜電位下降，與文獻(xiàn)[5，11]報(bào)道一致。

表2 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=3，±s）

表2 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=3，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05；與LPS組比：bP＜0.05

表3 各組線粒體PINK1和Parkin蛋白表達(dá)比較（n=3，±s）

表3 各組線粒體PINK1和Parkin蛋白表達(dá)比較（n=3，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05；與LPS組比：bP＜0.05

線粒體自噬是細(xì)胞通過(guò)自噬清除損傷線粒體的過(guò)程，能夠介導(dǎo)氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷[9，12]。ROS增加細(xì)胞內(nèi)PINK1表達(dá)，并使PINK1募集Parkin于線粒體上，促進(jìn)自噬體吞噬損傷的線粒體[13]；而氧化清除劑N-乙酰半胱氨酸通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)ROS，抑制LC3- II/LC3-I和PINK1表達(dá)[14]。FENG等[15]發(fā)現(xiàn)抑制過(guò)氧硝酸鹽誘導(dǎo)的線粒體自噬能抑制腦缺血再灌注損傷。TANG等[16]發(fā)現(xiàn)人參皂苷通過(guò)調(diào)控線粒體自噬平衡，抑制糖氧缺乏誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷。鄭麗云等[17]研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠通過(guò)線粒體自噬抑制糖氧缺乏星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組LC3- II/I、Beclin1、PINK1、Parkin表達(dá)顯著增高，說(shuō)明LPS處理后細(xì)胞內(nèi)自噬水平增加，而用LPS和Sal A共培養(yǎng)后，LC3- II/I、Beclin1、PINK1、Parkin表達(dá)降低，說(shuō)明Sal A拮抗LPS誘導(dǎo)線粒體自噬。進(jìn)一步提取線粒體蛋白，證實(shí)Sal A顯著降低LPS誘導(dǎo)的PINK1、Parkin表達(dá)。

綜上所述，本研究證實(shí)Sal A對(duì)LPS誘導(dǎo)的HPMVECs具有保護(hù)作用，但由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未應(yīng)用陽(yáng)性對(duì)照，僅反映了Sal A降低了LPS誘導(dǎo)的ROS含量，穩(wěn)定了線粒體膜電位和降低了線粒體自噬水平，仍無(wú)法證實(shí)三者及其相互關(guān)系在Sal A抑制LPS誘導(dǎo)HPMVECs損傷中的作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] BERNARD G. Acute lung failure-our evolving understanding of ARDS[J]. N Engl J Med, 2017, 377(6): 507-509.

[2] ZOU Y, BAO S, WANG F, et al. FN14 blockade on pulmonary microvascular endothelial cells improves the outcome of sepsis-induced acute lung injury[J]. Shock, 2018, 49(2):213-220.

[3] STANDIFORD T J, WARD P A. Therapeutic targeting of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome[J].Transl Res, 2016, 167(1): 183-191.

[4] FAN H Y, YANG M Y, QI D, et al. Salvianolic acid A as a multifunctional agent ameliorates doxorubicin-induced nephropathy in rats[J]. Sci Rep, 2015, 5: 12273.

[5] CHEN Y C, YUAN T Y, ZHANG H F, et al. Salvianolic acid A attenuates vascular remodeling in a pulmonary arterial hypertension rat model[J]. Acta Pharmacol Sin, 2016, 37(6):772-782.

[6] 邱偉文, 鄭麗云, 鄔至平, 等. 腦心通對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和自噬的影響[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 46(5): 340-343.

[7] SHADEL G S, HORVATH T L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis[J]. Cell, 2015, 163(3): 560-569.

[8] ROWLANDS D J. Mitochondria dysfunction: A novel therapeutic target in pathological lung remodeling or bystander?[J]. Pharmacol Ther, 2016, 166: 96-105.

[9] LEE J, GIORDANO S, ZHANG J. Autophagy, mitochondria and oxidative stress: cross-talk and redox signalling[J].Biochem J, 2012, 441(2): 523-540.

[10] GUIDARELLI A, FIORANI M, CERIONI L, et al. Arsenite induces DNA damage via mitochondrial ROS and induction of mitochondrial permeability transition[J]. Biofactors,2017, 43(5): 673-684.

[11] MAO K, SHU W, QIU Q, et al. Salvianolic acid A protects retinal pigment epithelium from OX-LDL-induced inflammation in an age-related macular degeneration model[J].Discov Med, 2017, 23(125): 129-147.

[12] PIANTADOSI C A, SULIMAN H B. Mitochondrial dysfunction in lung pathogenesis[J]. Annu Rev Physiol, 2017,79: 495-515.

[13] XIAO B, GOH J Y, XIAO L, et al. Reactive oxygen species trigger Parkin/PINK1 pathway-dependent mitophagy by inducing mitochondrial recruitment of Parkin[J]. J Biol Chem,2017, 292(40): 16697.

[14] WEI X, QI Y, ZHANG X, et al. Cadmium induces mitophagy through ROS-mediated PINK1/Parkin pathway[J]. Toxicology Methods, 2014, 24(7): 504-511.

[15] FENG J, CHEN X, GUAN B, et al. Inhibition of peroxynitrite-induced mitophagy activation attenuates cerebral is chemia-reperfusion injury[J]. Mol Neurobiol (2018). https://doi.org/10.1007/s12035-017-0859-x.

[16] TANG X, CHEN N, LONG X. Ginsenoside Rg1 improves is chemic brain injury by balancing mitochondrial biogenesis and mitophagy[J]. Trop J Pharm Res, 2017, 16(10): 2469-2475.

[17] 鄭麗云, 黃慧芬, 邱偉文. 紅景天苷對(duì)缺氧缺糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體自噬的影響[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2017, 47(10): 744-747.