間歇性低壓低氧預(yù)處理對SD大鼠放射性肝損傷的保護作用

徐 麗， 葉 華， 鄒 蘊， 李文軍， 夏紅娟， 袁 芳

(新疆軍區(qū)總醫(yī)院放療科， 烏魯木齊 830054)

放射治療目前已成為腫瘤治療重要的手段之一，射線造成危及器官損傷是制約放射治療的主要因素，肝臟屬于放射敏感器官[1]，放射性肝損傷(radiation-induced liver injury，RILI)就是肝臟受到射線照射后，肝細胞產(chǎn)生的一系列生理、病理變化造成的肝組織損傷[2]，是繼發(fā)于腹部放射治療最嚴重且制約著腹部腫瘤劑量遞增的致死性并發(fā)癥之一[3]。隨著放射治療設(shè)備的不斷創(chuàng)新以及放射治療技術(shù)的不斷改進，肝癌放療導(dǎo)致的胃腸道和消化道的并發(fā)癥降低，但放射性肝損傷仍然有發(fā)生，嚴重制約著腫瘤放射治療劑量的增加以及肝膽腫瘤的再程放療[4]。間歇性低壓低氧預(yù)處理(intermittent hypobaric hypoxia preconditioning，IHHP)是指間斷模擬高海拔的低壓低氧，在兩次低壓低氧之間恢復(fù)復(fù)常壓常氧環(huán)境[5]。作為增強機體和組織缺氧耐受性的手段，低壓低氧已被廣泛使用。本研究將SD大鼠作為研究對象，間歇性模擬高原海拔環(huán)境，探討低壓低氧對大鼠肝臟的影響，并進一步探討低壓低氧對放射性肝損傷能否產(chǎn)生保護作用。

1 材料與方法

1.1動物來源及分組24只健康雄性SPF級SD大鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)驗動物中心[SCXK(新)2011-0004]，體質(zhì)量180～220 g/只，隨機分為對照組(C組)、4 000 m低壓低氧預(yù)處理組(IHHP組)、單純照射組(R組)和低壓低氧預(yù)處理聯(lián)合照射組(IHHP+R組)，每組6只，C組大鼠在常壓常氧環(huán)境中飼養(yǎng)，低壓低氧環(huán)境均在西北特殊環(huán)境人工實驗艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制)中進行，IHHP組大鼠通過實驗艙模擬海拔高度4 000 m的高原環(huán)境，每天進艙6 h，每日進1次，1 w進艙5次，每日進艙時間基本固定，出艙后在常壓常氧環(huán)境中飼養(yǎng)。分組后大鼠標記編號，分籠飼養(yǎng)，3只/籠，標準嚙齒類動物飼料常規(guī)飼養(yǎng)，飲水設(shè)施、整個實驗過程對動物處置嚴格按照倫理學(xué)要求。實驗開始前，所有大鼠在新疆軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗科動物飼養(yǎng)中心[SYXK(新)2011-0003]適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.2照射方法照射組大鼠照射前通過3%戊巴比妥鈉腹腔注射(0.1 mL/100 g)麻醉，麻醉成功后將大鼠固定在木質(zhì)的固定板上，選擇右半肝照射，根據(jù)大鼠肝臟的位置及肝臟與鄰近器官的關(guān)系確定好照射野，并在體表標記，照射野大小3 cm×2 cm×1.5 cm，內(nèi)側(cè)界：大鼠腹中線，外側(cè)界：開放，上界：膈頂，下界：距上界2 cm。射線類型：6 MV X射線，源皮距(Source Skin Distance，SSD) =100 cm，照射深度(d)=1.5 cm，照射劑量率：600 cGy/min，照射總劑量(Total dose，DT)=60 Gy，2 Gy次/d，周一至周五照射，周末休息。整個實驗過程每天測量體質(zhì)量，詳細記錄所有大鼠的生物學(xué)行為，大鼠精神、活動狀態(tài)、飲食、大小便情況，照射組大鼠照射野的皮膚、有無脫毛等情況。

1.3采血所有實驗結(jié)束后6 h， 3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，固定好大鼠打開腹腔，找到下腔靜脈采血5 mL，檢測肝功能，主要比較谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)的變化。完成采血后，完整的暴露肝臟并觀察肝臟的大體形態(tài)：大小、 形狀、質(zhì)地、顏色。選擇照射野內(nèi)的肝臟組織，切取1 cm×1 cm×1 cm大小， 10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片， HE染色光鏡下觀察病理形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠ALT、AST的比較與C組相比，R組ALT、AST均升高，IHHP+R組轉(zhuǎn)氨酶AST值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，IHHP組大鼠經(jīng)過低壓低氧預(yù)處理后，轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，IHHP+R組與R組比較，預(yù)處理后轉(zhuǎn)氨酶值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 照射與HHP預(yù)處理對大鼠轉(zhuǎn)氨酶ALT、 AST的影響

注：與C組比較，*P<0.05；與 R組比較，ΔP<0.05。

2.2各組大鼠肝臟大體形態(tài)C組大鼠肝臟顏色鮮紅，質(zhì)地軟(圖1a)，與C組大鼠肝臟比較，R組大鼠照射部位肝臟顏色變暗，其余無明顯變化(圖1b)，IHHP組大鼠肝臟無明顯變化(圖1c)，IHHP+R組大鼠肝臟有輕度充血，余無明顯變化(圖1d)。

2.3各組大鼠肝臟病理形態(tài)C組大鼠肝臟肝細胞排列整齊(圖2a)，R組大鼠肝臟中央靜脈、肝竇擴張充血，肝細胞水腫，肝細胞出現(xiàn)空泡樣變性(圖2b)，IHHP組大鼠肝臟病理心態(tài)與對照組大鼠類似(圖2c)，IHHP+R組大鼠肝臟中央靜脈、肝竇擴張充血，肝細胞空泡樣變性數(shù)量及程度較照射組明顯減輕(圖2d)。

a: C組大鼠肝臟

b: R組大鼠肝臟

c: IIHP組大鼠肝臟

d: IHHP+R組大鼠肝臟

圖1各組大鼠肝臟大體形態(tài)

a: C組

b: R組

c: IHHP組

d: IHHP+R組

圖2各組大鼠肝組織HE染色觀察(×100)

3 討論

目前國內(nèi)外在放射治療中面臨的一個突出問題仍然是如何在殺滅腫瘤的同時又能保護正常組織及重要器官。放射性肝損傷是放射治療導(dǎo)致的亞急性、慢性肝臟損傷，是胸部以及上腹部腫瘤放療和骨髓移植前預(yù)處理中最嚴重的并發(fā)癥之一，極大影響胸腹部腫瘤尤其是肝癌放療的療效[6-7]。

肝臟照射后會引起肝功損傷，ALT、AST會有不同程度的升高，Cheng等[8]研究結(jié)果也表明放射性肝臟疾病(radiation-induced liver disease，RILD)大鼠肝功檢測ALT、AST以及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)明顯增加。本研究中將SD大鼠放進低壓低氧艙模擬高海拔環(huán)境進行低壓低氧預(yù)處理，處理后對大鼠進行右半肝照射，IHHP+R組與R組比較，預(yù)處理后ALT、AST值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。照射后大鼠肝臟大體顏色變暗，與吳戈等[9]放射性肝損傷模型建立的研究中對大鼠肝臟大體形態(tài)的描述相似，照射后顏色由鮮紅逐漸變?yōu)榘导t，IHHP組大鼠肝臟大體變化不大，可能與低氧處理有關(guān)。Berthrong 等[10]認為肝臟急性損傷效應(yīng)(又稱急性放射性肝炎)的主要病理學(xué)特征表現(xiàn)為肝小葉中央靜脈閉塞性損傷(venous occlusive disease, VOD)。照射后大鼠肝臟中央靜脈、肝竇擴張充血，肝細胞水腫，肝細胞出現(xiàn)空泡樣變性，經(jīng)過預(yù)處理后的大鼠肝細胞水腫程度及中央靜脈、肝竇淤血程度較R組大鼠減輕，表明IHHP可以減輕大鼠肝臟照射后引起的損傷。Yuan等[11]研究表明慢性間歇性低壓低氧預(yù)處理可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷減輕代謝綜合征大鼠模型的肝損傷。Wang等[12]研究表明慢性間歇性低壓低氧處理可以減輕放射性心臟功能損傷和纖維化，這種保護作用可能與低壓低氧抑制氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。

間歇性低壓低氧預(yù)處理可以增強機體對缺血、缺氧的耐受性，對心臟、神經(jīng)、肝臟等組織器官產(chǎn)生保護作用[13-14]。HHP通過上調(diào)組織熱休克蛋白70來降低全身的炎癥因分子和器官組織毒性損傷[15]。Yan等[16]研究表明低壓低氧預(yù)處理可能通過增加自由基清除能力，減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)及上調(diào)抗凋亡蛋白表達等方式減輕腎臟缺血再灌注損傷后所致的肝臟損傷。慢性間歇性低壓低氧對大鼠心臟缺血再灌注損傷有保護作用，這種保護作用可能與蛋白激酶C的激活有關(guān)[17]。針對抑郁癥動物模型，間歇性低氧預(yù)處理有類似于抗抑郁藥治療抑郁的潛能[18-19]，或許可以成為治療這類病理生理狀態(tài)的一個選擇。Xu等[20]結(jié)果說明心臟驟停后低氧處理能提供保護作用，通過增加缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達。相關(guān)放療防護方面的研究發(fā)現(xiàn)低氧放療能提高結(jié)直腸癌患者的遠期生存率[21]。孫衍偉等[22]關(guān)于中晚期胰腺癌低氧放療的研究也表明低氧放療能提高患者的遠期生存率，降低胰腺癌患者的遠處轉(zhuǎn)移率，可能與低氧放療保護了正常組織，改善了患者的免疫功能有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)過間歇性低壓低氧預(yù)處理后行右半肝照射，大鼠轉(zhuǎn)氨酶下降，病理形態(tài)損傷減輕，說明低壓低氧能降低放射性造成的肝臟損傷。

綜上所述，低壓低氧預(yù)處理后行半肝照射可以對肝臟產(chǎn)生一定的保護作用，這或許能為放射性肝損傷的防護提供一條新的思路，但預(yù)處理時間的長短是否合適、預(yù)處理高度是否合理等問題還需要進一步的探討。

參考文獻:

[1] 董天明, 安寧豫. 放射性肝損傷影像學(xué)研究現(xiàn)狀[J]. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報, 2013, 35(6):694-697.

[2] 趙增虎, 劉俊堂, 范青建．放射性肝損傷研究及防治進展[J]．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011, 19(10):2110-2113.

[3] KIM J, WANG S, HYUN J, et al. Hedgehog signaling is associated with liver response to fractionated irradiation in Mice[J]. Cell Physiol Biochem, 2016, 40(1/2):263-276.

[4] DOI H, SHIOMI H, MASAI H, et al. Threshould doses and prediction of visually apparent liver dysfunction after stereotactic body radiation therapy in cirrhotic and normal livers using magnetic resonance imaging[J]. J Radiat Res, 2016, 57(3):294-300.

[5] ZHANG Y, ZHOU Z N. Beneficial effects of intermittent hypobaric hypoxia on the body[J]. Chin J Appl Physiol, 2012, 28(6):504-509.

[6] CHEN W, ZHENG R, BAADE P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2):115-132.

[7] 江林官, 孟鴻宇, 張火俊. 放射性肝損傷的研究進展[J]. 世界華人消化雜志, 2017, 25(20)：1811-1818.

[8] CHENG W, XIAO L, AINIWAER M, et al. Molecular responses of radiation-induced liver damage in rats[J]. Mol Med Rep, 2015, 11(4):2592-2600.

[9] 吳戈，肖蕾，張瑞麗，等. 急性放射性肝損傷大鼠模型的建立與評價[J]. 中國實驗動物學(xué)報，2015,23(2):178-181.

[10] BERTHRONG M, FAJARDO L F. Radiation injury in surgical pathology. part II. alimentary tract.[J]. Am J Surg Pathol, 1981, 5(2):153-78.

[11] YUAN F, TENG X, GUO Z, et al. Chronic intermittent hypobaric hypoxia ameliorates endoplasmic reticulum stress mediated liver damage induced by fructose in rats[J]. Life Sci, 2015(121):40-45.

[12] WANG J, WU Y, YUAN F, et al. Chronic intermittent hypobaric hypoxia attenuates radiation induced heart damage in rats[J]. Life Sci, 2016(160):57-63.

[13] BRENNAN S, JACKON R, PATEL M, et al. Early opening of sarcolemmal ATP-sensitive potassium channels is not a key step in PKC-mediated[J]. J Mol Cell Cardiol, 2015(79):42-53.

[14] ZHU X H, YAN H C, ZHANG J, et al. Interrmittent hypoxia promotes hippocompal neurogenesis and produces antidepressant-like effects in adult rats[J]. J Neurosci, 2010, 30(38):12653-12663.

[15] WANG C T, LIN H J, CHENG B C, et al. Attenuating systemic inflammatory markers in simulated high-altitude exposure by heat shock protein 70-mediated hypobaric hypoxia preconditioning in rats[J]. J Formos Med Assoc, 2015, 114(4):328-338.

觀察組護士安全管理意識、安全防范完善性優(yōu)于對照組,P<0.05,其中,觀察組護士安全管理意識、安全防范完善性96.55±2.89分、98.62±1.78分優(yōu)于對照組82.50±3.13分、82.67±2.27分,P<0.05。

[16] YAN N, FENG Z G, YAN G T, et al. Effect of repeated hypoxia preconditioning on renal ischemia-reperfusion-induced hepatic dysfunction in rats[J]. J South Med Univ, 2015, 35(1):149-153.

[17] MA H J, LI Q, MA H J, et al. Chronic intermittent hypobaric hypoxia ameliorates ischemia/reperfusion-induced calcium overload in heart via Na/Ca2+exchanger in developing rats[J]. Cell Physiol Biochem, 2014, 34(2):313-324.

[18] KANEKAR S, BODGANOVA O V, OLSON P R, et al. Hypobaric hypoxia induces depression-like behavior in female sprague-dawley rats, but not in males[J]. High Alt Med Biol, 2015, 16(1):52-60.

[19] KUSHWAH N, JAIN V, DEEP S, et al. Neuroprotective role of intermittent hypobaric hypoxia in unpredictable chronic mild stress induced derression in rats[J]. PLoS One, 2016, 11(2):e0149309.

[20] XU K, LAMANNA J C. Short-term hypoxic preconditioning improved survival following cardiac arrest and resuscitation in rats[J]. Adv Exp Med Biol, 2014(812):309-315.

[21] PRPROKOV V V, GOLDOBENKO G V, NIKOLAEV A V, et al. Long-term results of surgery and preoperative hypoxyradiotherapy for colorectal cancer[J]. Vopr Onkol, 2011(57):99-101.

[22] 孫衍偉，安永恒. 低氧放療對中晚期胰腺癌的放射防護作用[J]. 中華胰腺病雜志，2013， 13(1)：40-41.