芪茵顆粒對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織SREBP-1、SREBP-2的影響

王 潔, 陳俊玲, 楊 旋, 喬治園, 曾斌芳

(1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科， 烏魯木齊 830001)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以遺傳環(huán)境、胰島素抵抗、脂代謝紊亂為特征的一種代謝應(yīng)激性肝損傷，其病理變化與酒精性肝病(ALD)相似，但患者無過量飲酒史,包括非酒精性脂肪性肝炎( NASH)、非酒精性單純性脂肪肝(NAFL)、NASH相關(guān)肝硬化(LC)和肝細(xì)胞癌(HCC)[1]。NAFLD有著復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，已嚴(yán)重威脅到人類健康，許多理論仍處于假說階段，Day[2]提出的二次打擊理論是1988年至今最具影響力的理論。本課題前期研究表明[3-4]，芪茵顆粒能明顯改善 NAFLD患者肝功能，體質(zhì)指數(shù)(BMI)、血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST);血脂中高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)等指標(biāo)，未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，然而，目前對其作用機(jī)制還不清楚。本研究旨在探討芪茵顆粒對NAFLD大鼠肝組織中固醇調(diào)節(jié)元件蛋白1(SREBP-1)、固醇調(diào)節(jié)元件蛋白2(SREBP-2)表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其對NAFLD的治療作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量(200±20)g，大鼠(SPF級)由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科技樓實(shí)驗(yàn)動物中心提供[實(shí)驗(yàn)動物許可編號：SCXK(新)2014-0011]。

1.2試劑與儀器硫普羅寧片(批號：P20150307-2)，河南省新宜藥業(yè)有限公司；SREBP-1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號：DRE21279)，武漢基因美生物科技有限公司；SREBP-2酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號：DRE21283)，武漢基因美生物科技有限公司；石蠟切片機(jī)(型號：LEICA RM2135)；三目顯微鏡(型號：DM3000B)；臺式離心機(jī)(型號：TD5AWS)。

1.3實(shí)驗(yàn)藥物“芪茵顆?！泵饧鍎?由生黃芪、茵陳、生山楂、澤瀉、生大黃、三七粉、補(bǔ)骨脂、決明子、苦丁茶等組成)，購于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院(江蘇天江藥業(yè)提供),用溫水混合芪茵顆粒，煎煮5 min，生藥濃度1 g/mL。

1.4動物模型的制備及分組給藥方法將雄性SD大鼠72只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、空白對照組、芪茵顆粒低、中、高劑量組和陽性藥物硫普羅寧(商品名：凱西萊)組，進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，每組各12只，除空白對照組予常規(guī)飼養(yǎng)外，剩余 5組灌胃高脂乳劑(30 g豬油，10 mL吐溫，10 g膽固醇，10 mL丙二醇、3 g豬膽酸加蒸餾水至100 mL)，每日1次，每次10 mL/kg體質(zhì)量，持續(xù)灌胃10 w，建立NAFLD模型，第10周末隨機(jī)在各組間抽取大鼠2只，用12只大鼠肝組織制作肝臟病理切片，觀察肝臟組織病理學(xué)變化，確定造模成功。從第10周起，各組大鼠飲食恢復(fù)正常，空白對照組和模型組予10 mL/kg體質(zhì)量蒸餾水灌胃，芪茵顆粒低、中、高劑量組分別以2.5、5、10 mL/kg體質(zhì)量灌胃治療，硫普羅寧組給藥劑量為20 mg/kg體質(zhì)量灌胃，時間為10 w。

1.5取材與處理末次給藥后12 h，大鼠禁食不禁水，測體質(zhì)量并記錄，10%的水合氯醛(3 mL/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉，大鼠開腹，分離出完整肝臟后稱重并記錄，取肝左葉相同部位的肝組織，勻漿機(jī)勻漿，取上清液-20℃保存待用；取肝右葉邊緣約1 cm×1 cm×0.5 cm 組織，4%多聚甲醛24 h過夜固定，不同濃度酒精脫水，浸蠟、包埋，切片、烤片，伊紅蘇木精染色，封片，光鏡下觀察肝組織形態(tài)。

1.6指標(biāo)的檢測動物體質(zhì)量及肝指數(shù)：肝指數(shù)=肝濕重/體質(zhì)量×100%；肝組織病理學(xué)：取肝臟組織石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察；組織勻漿用ELISA法測定SREBP-1、SREBP-2的含量。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)的變化芪茵顆粒低、中、高劑量組治療前、后大鼠體質(zhì)量增長的速度明顯低于模型組大鼠治療前、后體質(zhì)量的增長(P<0.05)。與模型組相比，芪茵顆粒中、高劑量組治療后的體質(zhì)量明顯減少(P<0.05)，芪茵顆粒低劑量組體質(zhì)量與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與芪茵顆粒低劑量組相比，芪茵顆粒中、高劑量組體質(zhì)量減少更為顯著(P<0.05)。與空白對照組相比，模型組肝指數(shù)明顯增高(P<0.05)。治療后芪茵顆粒高、中、低劑量組肝指數(shù)與模型組相比均降低(P<0.05)，見表1。

表1 芪茵顆粒對NAFLD大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)的影響

注：與模型組比較,aP<0.05； 與空白對照組比較,bP<0.05； 與芪茵顆粒低劑量組比較，cP<0.05。

2.2芪茵顆粒對NAFLD大鼠肝組織病理學(xué)變化的影響空白對照組大鼠組織可見結(jié)構(gòu)清楚的肝小葉，并伴有完整排列的肝索，無脂肪變。模型組大鼠可見排列雜亂的肝索，并伴隨明顯的肝細(xì)胞體積變大、水腫等存在于不同大小的胞漿內(nèi)，可見脂肪空泡，細(xì)胞核受壓移位，炎癥細(xì)胞浸潤的肝小葉，以及中度及重度肝細(xì)胞脂肪變性，其肝臟NAS積分與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，芪茵顆粒高、中、低劑量組及硫普羅寧組均能不同程度的降低肝臟NAS積分，減輕肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥浸潤和細(xì)胞水腫。與硫普羅寧組相比，芪茵顆粒中、高劑量組能顯著降低肝臟NAS積分(P<0.05)。與芪茵顆粒低劑量組比較，芪茵顆粒中劑量組和高劑量組均能顯著降低肝臟NAS積分(P<0.05)。芪茵顆粒中劑量組和高劑量組內(nèi)炎性滲出與水腫明顯減少，偶見少量脂肪滴散在分布，可見清晰整齊的肝小葉及肝索,結(jié)果見圖1和表2。

A：空白對照組

B：模型組

C：硫普羅寧組

D：芪茵顆粒高劑量組

E：芪茵顆粒中劑量組

F：芪茵顆粒低劑量組

圖1 NAFLD大鼠肝組織HE染色病理切片(×200) 表2 肝臟NAS活動度積分

注：與空白對照組比較，aP<0.05； 與模型組比較,bP<0.05； 與硫普羅寧組比較,cP<0.05; 與芪茵顆粒低劑量組比較,dP<0.05。

2.3芪茵顆粒對肝組織勻漿中SREBP-1、SREBP-2含量的影響與空白對照組比較，模型組、芪茵顆粒高、中、低劑量組及硫普羅寧組SREBP-1、SREBP-2含量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芪茵顆粒高、中、低劑量組及硫普羅寧組SREBP-1、SREBP-2含量均明顯降低(P<0.05)；與硫普羅寧組比較，芪茵顆粒高、中劑量組SREBP-1、SREBP-2含量明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3各組大鼠肝組織SREBP-1、SREBP-2含量比較

組別只數(shù)SREBP-1SREBP-2空白組924.92±2.2212.52±0.62模型組965.51±2.12a42.08±1.53a硫普羅寧組1044.75±1.68ab24.18±1.37ab芪茵顆粒低劑量組951.67±1.75ab30.35±1.34ab芪茵顆粒中劑量組1039.38±1.85abc22.30±0.99abc芪茵顆粒高劑量組932.88±1.85abc19.31±1.39abc

注：與空白對照組比較，aP<0.05； 與模型組比較,bP<0.05； 與硫普羅寧組比較,cP<0.05。

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，新疆地區(qū)人民物質(zhì)生活水平得到了極大提高，NAFLD發(fā)病率逐年上升,并影響著人們的健康。2010年4-6月，對來自克拉瑪依市健康體檢中心的2 858例健康人群和天河社區(qū)全體居民進(jìn)行了NAFLD患者分析，結(jié)果表明[5]：NAFLD患病人數(shù)為1 043例，總患病率為36.49%。非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多變，脾腎虧虛，瘀濁內(nèi)阻肝絡(luò)是諸多學(xué)者較為認(rèn)同的觀點(diǎn)。芪茵顆粒是新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定處方，根據(jù)非酒精性脂肪肝“肝脾腎同調(diào)，痰瘀滯同治” 的創(chuàng)新理論組方，針對脾腎兩虛，痰瘀互結(jié)的病機(jī)關(guān)鍵，以虛濕瘀滯并治，肝脾腎同調(diào)為主要治則?！败我痤w?！狈街幸陨S芪、茵陳二者為君，補(bǔ)脾胃同時亦可清肝之濕熱；以三七粉、決明子二者為臣，祛瘀化濁，清熱解郁；生大黃、生山楂、澤瀉、補(bǔ)骨脂四藥共佐，祛瘀活血、滋補(bǔ)肝腎；苦丁茶為使，化痰清熱、化積消脂。組方精良，有良好的調(diào)理肝、脾、腎功能，有助于消化、祛濕、活血作用。

甾固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)在動物蛋白合成脂肪的過程中起到極為重要的作用，通過調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化及相關(guān)酶(生于脂肪酶)的轉(zhuǎn)化來調(diào)節(jié)這些酶的活性，從而控制脂肪合成基因的轉(zhuǎn)移[6]；SREBP-1a、SREBP-1c、SREBP-2 是參與調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的重要蛋白，其中SREBP更是肝臟脂肪酸代謝的重要途徑的關(guān)鍵因子，是屬于動物脂肪酶脂合酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、蘋果酸酶、L-丙酮酸激酶和S14蛋白的一部分[7]。正常情況下，大鼠肝臟SREBPs蛋白表達(dá)較低，當(dāng)受到高脂飲食的誘導(dǎo)下，其表達(dá)明顯增高，并與NAFLD的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，表明SREBPs表達(dá)的增強(qiáng)，可以導(dǎo)致脂肪酸代謝失衡，TG合成增多，從而導(dǎo)致非酒精性脂肪肝的發(fā)生[8]。本研究結(jié)果顯示芪茵顆粒能抑制NAFLD大鼠體質(zhì)量增長過快，并且能不同程度降低大鼠肝組織脂肪變性，并且與硫普羅寧組比較，芪茵顆粒高劑量組和中劑量組均能明顯降低NAFLD大鼠肝組織中SREBP-1、SREBP-2的含量，表明芪茵顆粒能夠降低NAFLD大鼠肝組織中SREBP-1、SREBP-2的含量，并且可顯著改善肝組織脂肪變性，從而糾正脂肪酸代謝失衡，阻止NAFLD的發(fā)生。

綜上所述，芪茵顆粒可以控制NAFLD大鼠體質(zhì)量增長，顯著改善NAFLD大鼠肝指數(shù)和肝組織脂肪變性，降低NAFLD大鼠肝組織中SREBP-1、SREBP-2的含量，調(diào)節(jié)與脂肪生成相關(guān)酶(生脂酶)的基因轉(zhuǎn)求而調(diào)節(jié)這些酶的活性，減少肝組織脂質(zhì)沉積，從而發(fā)揮治療NAFLD的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性肝病診療指南(2010年修訂版)[J].中華肝臟病雜志，2010，19(6)：483-487.

[2] DAY CP. Non-alcoholic fatty liver disease:a massive problem[J].Clin Med，2011,11(2)：176-178.

[3] 張金穎，曾斌芳.芪茵顆粒治療酒精性脂肪肝的臨床療效分析[J].新疆中醫(yī)藥雜志，2008，26(2)：19-20.

[4] 趙智宏，王轉(zhuǎn)國，陳俊玲，等.芪茵茶治療非酒精性脂肪肝(肝郁脾虛型)56例臨床觀察[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2010，31(5)：21-22.

[5] 崔喜聞.新疆克拉瑪依市居民非酒精性脂肪肝流行病學(xué)調(diào)查[D].烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學(xué)，2012.

[6] STCETKMAN A K, TOWLE H C. The role of SREBPl nutritional regulation of lipogenic enzynle gone expression[J]. Biol Chem， 2002, 277(30):27029-27035.

[7] YU-POTH S, YIN D, KRIS-ETHERTON P M, et al. Long-chain poly-unsaturated fatty acids upregulate LDL receptor protein expression in fibroblasts and HepG2 Cells[J]. J Nutr， 2005,135(11)：2541-2545.

[8] 艾正琳,陳東風(fēng).SREBP-1c在大鼠非酒精性脂肪性肝病中的表達(dá)及意義[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(10)：1063-1065.