多孔明膠微球?qū)Υ笫笾靖杉?xì)胞的生物相容性實驗

楊 軒，孟昊業(yè)，劉 偉，魯長風(fēng)，全 琦，孫 遜，衛(wèi)光星，杜亞楠，彭 江，汪愛媛解放軍總醫(yī)院 骨科研究所/北京市再生醫(yī)學(xué)重點實驗室/全軍戰(zhàn)創(chuàng)傷重點實驗室，北京 0085；清華大學(xué)，北京 0008；南開大學(xué)，天津 0007；部隊，山西大同 07000

種子細(xì)胞和生物支架材料的選擇是組織工程治療的兩大基本要素。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)具有可控性高、潛在致瘤風(fēng)險低、來源廣泛、倫理爭議少、低免疫原性、分離培養(yǎng)方法簡單等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于組織工程治療領(lǐng)域[1-7]。明膠是膠原部分水解而得到的一類蛋白質(zhì)，是一種天然的高分子材料，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與膠原相似，其降解產(chǎn)物易被吸收而不易產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，有利于細(xì)胞增殖和黏附，具有良好的生物相容性，是理想的生物組織工程材料[8-9]。最新研究表明，利用明膠制成的微球可以明顯改善微環(huán)境氧濃度，為干細(xì)胞提供營養(yǎng)支持，增加細(xì)胞成活概率，提高細(xì)胞增殖能力[10-11]。本研究擬采用多孔明膠微球作為支架，選用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，探討兩者之間生物相容性，為進(jìn)一步治療骨科損傷確定實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實驗動物和材料 5只2 d齡雄性SD乳鼠均購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；PBS緩沖液(Hyclone公司，美國)；無水乙醇(分析純AR，北京化工廠，中國)；0.05%胰酶(Gibco，US)；胎牛血清(Gibco，美國)；Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國)；青/鏈霉素(雙抗)混合液(Gibco，美國)；LIVE/DEAD染色試劑盒(Invitrogen)；MTT試劑(Amresco，美國)；大鼠脂肪間充質(zhì)成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo)試劑盒(Cyagen，美國)；多孔明膠微球由清華大學(xué)制備和提供。

2 掃描電鏡觀察多孔明膠微球 掃描電鏡(Hitachi S-4800)觀察多孔微球微觀結(jié)構(gòu)和孔徑大小。

3 大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和三系誘導(dǎo) 取SD雄性2 d大鼠3只，頸椎脫臼法處死后，75%乙醇浸泡消毒5 min后轉(zhuǎn)移入超凈臺。無菌條件下取出腹股溝脂肪組織，用含5%雙抗的PBS漂洗3遍。用已滅菌的眼科剪將脂肪組織剪成1 mm3的碎塊，移入錐形瓶，加入10倍脂肪體積的含0.1%Ⅱ型膠原酶的DMEM，37℃恒溫水浴中震蕩消化20 min。收集消化液1 700 r/min離心5 min，棄上清。用間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于6 cm培養(yǎng)皿，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，細(xì)胞達(dá)80%左右融合時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行消化，以1∶2傳代。取P3代ADSCs，分別按照成脂、成軟骨和成骨的相應(yīng)說明書方法進(jìn)行三系誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)結(jié)束后，分別進(jìn)行油紅O、阿爾新藍(lán)、茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察、拍照。

4 ADSCs復(fù)合微球?qū)嶒?采用60Co照射的方法滅菌微球。取P2代ADSCs，胰酶消化，制成細(xì)胞密度為107/ml的細(xì)胞懸液，吸取200μl滴加于20 mg經(jīng)消毒的微球上，靜置復(fù)合2 h后，轉(zhuǎn)移至六孔板中，加入培養(yǎng)基，置入37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5 細(xì)胞增殖實驗 取上述復(fù)合有細(xì)胞的微球，置于96孔板中培養(yǎng)，加入100μl培養(yǎng)液，按上述微球復(fù)合細(xì)胞比例計算細(xì)胞數(shù)，使每孔初始細(xì)胞數(shù)約為2×103個，設(shè)5個復(fù)孔，此為微球復(fù)合細(xì)胞組。再取P2代ADSCs，胰酶消化，計數(shù)，置入96孔板培養(yǎng)，每孔初始細(xì)胞數(shù)為2×103個，設(shè)5個復(fù)孔，此為單純細(xì)胞對照組。按照MTT試劑方法操作，酶標(biāo)儀測定兩組分別在1 d、3 d和5 d時490 nm波長下的OD值。

6 細(xì)胞毒性實驗 用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基按照ISO10993標(biāo)準(zhǔn)制備浸提液，無菌封裝，4℃保存。取第3代ADSCs，胰酶消化，計數(shù)，接種于96孔板，每孔2×103/100μl，共10孔。然后移除上清，向其中5孔加入浸提液，每孔100μl，此為浸提液組(100% leach liquor)。另外5孔都加入正常的干細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔100μl，作為陰性對照組(Negative control)。按照MTT試劑方法操作，酶標(biāo)儀測定兩組分別在1 d、3 d和5 d時490 nm波長下的OD值。

7 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞增殖活性 分別在微球復(fù)合細(xì)胞后第2天和5天，使用LIVE/DEAD試劑盒，按照說明書進(jìn)行染色，采用激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)觀察細(xì)胞在微球上的形態(tài)、死活及增殖情況。

8 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 多孔明膠微球的微觀結(jié)構(gòu) 普通光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡結(jié)果顯示多數(shù)微球直徑為100 ～ 400μm，掃描電鏡結(jié)果顯示微球孔徑為20 ～ 90μm，孔隙率約為93%(圖1)。

2 ADSCs形態(tài)學(xué)觀察 ADSCs在P0、P1、P2代都呈長梭形，少量細(xì)胞為多角形、圓形；細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，融合率達(dá)到80% ～90%，細(xì)胞呈旋渦狀生長，部分細(xì)胞集落間有融合現(xiàn)象 (圖 2)。

3 ADSCs的三系分化誘導(dǎo)結(jié)果及鑒定 成脂誘導(dǎo)10 d后，大部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)圓形脂滴，油紅O染色后，脂滴呈紅色；成軟骨誘導(dǎo)3周后，細(xì)胞團(tuán)聚集成小球，阿爾新藍(lán)染色后成，基質(zhì)呈淺藍(lán)色；成骨誘導(dǎo)15 d后，細(xì)胞呈層狀、結(jié)節(jié)狀生長，可看到明顯的鈣沉積結(jié)節(jié)，茜素紅染色呈紅色(圖3)。

4 細(xì)胞增殖實驗和毒性實驗 MTT實驗顯示，浸提液組與陰性對照組的OD值隨著培養(yǎng)時間遞增。浸提液組與陰性對照1 d、3 d、5 d的OD值無明顯差異(P均＞0.05)。同時，微球復(fù)合細(xì)胞組與單純細(xì)胞組相比，微球復(fù)合細(xì)胞組3 d和5 d的OD值明顯高于單純細(xì)胞組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P均＜0.05)，兩組的OD值隨著時間延長而增加(圖4)。

圖 1 多孔明膠微球的形態(tài)A： 普通光鏡(×200)； B： 掃描電鏡Fig. 1 Morphology of gelatin porous microspheresA: Optical microscope (×100)；B: Scanning electron microscope

圖 2 分離培養(yǎng)ADSCs的形態(tài) A：原代細(xì)胞形態(tài) (×100)； B：第一代細(xì)胞形態(tài) (×100)； C：第二代細(xì)胞形態(tài) (×100)Fig. 2 Morphology of cultured ADSCs A：Passage 0 (×100)； B：Passage 1 (×100)； C：Passage 2 (×100)

圖 3 ADSCs的三系誘導(dǎo)與鑒定 A: 成脂油紅O染色 (×100)； B: 成軟骨阿爾新藍(lán)染色 (×200)； C: 成骨茜素紅染色 (×100)Fig. 3 Three lineages differentiation and corresponding identification of ADSCs A: oil red staining for adipogenic induction (×100);B: alcian blue staining for chondrogenic induction (×200); C: alizarin red staining for osteogenic induction (×100)

圖 4 MTT檢測顯示細(xì)胞增殖實驗(A)和毒性實驗(B)(n.s.表示各個時間點，兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異)Fig. 4 Cell proliferation (A) and toxicity detection (B) by MTT assay (n.s.：no significance)

圖 5 共聚焦觀察細(xì)胞復(fù)合微球后增殖情況(綠色為活細(xì)胞)A：細(xì)胞復(fù)合微球2 d； B：細(xì)胞復(fù)合微球5 dFig. 5 Proliferation of cell on the microspheres observed with laser confocal. Green fluorescence indicated living cells A: cell incorporated into microspheres at 2 d； B: cell incorporated into microspheres at 5 d

5 ADSCs復(fù)合微球后增殖情況 激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，綠色熒光為活細(xì)胞，微球復(fù)合細(xì)胞5 d時與2 d時相比，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，微球間有聚集現(xiàn)象，這可能與細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積有關(guān) (圖 5)。

討 論

目前，多選取3 ～ 4周齡SD大鼠的脂肪組織進(jìn)行分離培養(yǎng)以獲得ADSCs，所獲得的ADSCs一般5 ～ 6 d傳代1次，尚未見報道選用SD乳鼠[12]。本實驗通過SD乳鼠所獲得的細(xì)胞2 ～ 3 d就可傳代1次，細(xì)胞形態(tài)以典型的長梭形為主，呈明顯的漩渦狀生長，符合干細(xì)胞的生長規(guī)律[13]。傳代周期明顯少于4周齡方法，細(xì)胞增殖明顯較快，證實了所獲干細(xì)胞活性較高，純度較好。另外，SD大鼠腹股溝皮下脂肪組織位置表淺，容易分離，操作簡單。周圍血管筋膜較少，分離所得干細(xì)胞純度較高，提高了脂肪組織利用率。然而，對比SD乳鼠與4周齡的大鼠脂腹股溝肪組織發(fā)現(xiàn)，SD乳鼠總體脂肪組織偏少，棕色脂肪所占比例較大，這是否為傳代時間明顯減少的原因需要進(jìn)一步實驗證實。是否具有多項分化潛能是鑒別間充質(zhì)干細(xì)胞和普通細(xì)胞的基本共識。本實驗取P3細(xì)胞分別進(jìn)行了成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)，結(jié)果顯示油紅O、茜素紅、阿爾新藍(lán)染色均為陽性，與相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[14]。

本實驗中MTT法檢測顯示細(xì)胞增殖結(jié)果中微球復(fù)合細(xì)胞組3 d和5 d的OD值明顯高于單純細(xì)胞組，說明多孔明膠微球可以明顯提高細(xì)胞增殖能力。另外，兩組都顯示了良好的細(xì)胞增殖曲線。而在毒性實驗中，浸提液組與陰性對照組各個時間點無顯著差異，說明該材料不具有明顯生物毒性。

設(shè)計生物支架的最初理念就是為細(xì)胞提供一個3D的適宜微環(huán)境，以利于細(xì)胞黏附，促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉淀[15]。新型的可注射微球結(jié)構(gòu)可以填充任意形狀的缺損從而避免了大開口外科修復(fù)移植，縮短了機(jī)體恢復(fù)時間[16]。有綜述指出，細(xì)胞復(fù)合微球后所分泌形成的細(xì)胞外基質(zhì)的一些特性與某些天然組織非常相似[17]。而生物材料的多孔性和大孔徑不僅加快了營養(yǎng)物質(zhì)交換，為細(xì)胞黏附增殖提供一個積極的生長微環(huán)境，而且增加了材料接觸表面積，有利于生物材料降解[16-18]。Huang等[19]成功地通過明膠微球把間充質(zhì)干細(xì)胞遞送到皮膚傷口處，防止了細(xì)胞流失，促進(jìn)了傷口愈合和瘢痕形成。在豬心梗模型中，劉瓊等[20]將干細(xì)胞或微載體注射到梗死區(qū)，3周的實驗結(jié)果表明，在明膠微球復(fù)合干細(xì)胞組中的毛細(xì)血管密度明顯多于單純細(xì)胞組，并且DAPI標(biāo)記的干細(xì)胞明顯更多。Li等[21]報道通過選取明膠多孔微球支架材料用以充當(dāng)遞送間充質(zhì)干細(xì)胞的運輸工具，不僅可以防止細(xì)胞流失，而且實現(xiàn)了細(xì)胞的大量擴(kuò)增，同時保護(hù)干細(xì)胞分泌功能。本實驗首次探討了多孔明膠微球?qū)Υ笫笾靖杉?xì)胞的相容性。實驗所用微球具有大孔徑，高孔隙率的特性，保證了細(xì)胞生長微循環(huán)營養(yǎng)物質(zhì)的及時流通和更新，提高了細(xì)胞增殖能力。共聚焦觀察顯示5 d時微球上的細(xì)胞數(shù)量明顯多于2 d時。

綜上所述，本實驗選取ADSCs作為種子細(xì)胞，明膠多孔微球作為材料支架，初步驗證了細(xì)胞與材料之間良好的生物相容性以及多孔微球?qū)?xì)胞黏附、增殖和分泌外基質(zhì)的促進(jìn)作用。為下一步的體內(nèi)注射植入奠定了基礎(chǔ)。

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