神經病理性疼痛大鼠中腦導水管周圍灰質腹外側區(qū)GABAAα1受體的表達變化

孫萬秋，王桂芝， 冀玉萍，李 軍

濰坊醫(yī)學院 麻醉學系，山東濰坊 261053

神經病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是一種以痛覺過敏、痛覺超敏、自發(fā)痛及感覺異常為特點的慢性病理性疼痛[1-2]。通常其形成原因復雜多樣，疼痛程度難以忍受，臨床治療效果欠佳，嚴重影響患者的工作生活質量。導致NP的原因包括組織損傷、感染、藥物毒素、外周神經損傷等，但其發(fā)病機制尚未完全闡明。NP的發(fā)病機制之一是突觸前抑制的減弱[3]，而抑制性神經遞質γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA)主要是借助γ-氨基丁酸A受體(γ-aminobutyric acid type A receptor，GABAAR)來實現在疼痛傳導中的作用。目前已有研究表明NP大鼠內側額葉前皮質GABAAα1受體表達上調可能參與了NP的形成與維持[4]，但NP大鼠中腦導水管周圍灰質腹外側區(qū)(ventrolateral periaqueductal gray，vLPAG)GABAAα1受體是否參與NP的表達尚未見報道。本研究旨在探討GABAAα1受體在NP大鼠vLPAG表達變化及其是否參與NP表達過程，為NP的治療提供新的思路。

材料和方法

1 實驗動物及分組 清潔級成年雄SD大鼠15只，體質量240 ～ 280 g，由青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。大鼠在安靜、溫暖、70%濕度的環(huán)境中飼養(yǎng)1周，隨機分為空白對照組(C組)、假手術組(S組)、神經病理性疼痛模型組(NP組)，每組5只。所有大鼠在造模前測基礎痛閾，剔除痛覺異常大鼠。

2 主要試劑與儀器 兔抗大鼠GAPDH和山羊抗兔IgG(Wanleibio)，兔抗大鼠GABAAα1受體抗體(AbSci)，Eppendorf臺式高速冷凍離心機，天能5200化學發(fā)光檢測系統(tǒng)，天能EPS300電泳系統(tǒng)。

3 坐骨神經分支選擇性損傷模型建立 采用Decosterd和Woolf[5]建立的坐骨神經分支選擇性損傷(spared nerve injury，SNI)模型，采用20%水合氯醛(0.2 ml/100 g腹腔注射)對大鼠進行麻醉，右側臥位固定于手術臺板上，備皮，消毒，順肢體方向，沿坐骨神經分叉處切開皮膚，鈍性分離肌肉，充分暴露并游離出坐骨神經及其遠心端分支：內側脛神經、中間腓總神經和外側腓腸神經，用4-0號絲線分別結扎脛神經與腓總神經并于遠心端切斷，術中輕柔操作，避免牽拉腓腸神經，確保完好無損，結扎完成后逐層縫合肌層和皮膚，縫合前涂抹肌注青霉素預防術后感染。假手術組只暴露游離神經，不結扎切斷，余操作相同。

4 大鼠機械縮足反射閾值測定 機械縮足反射閾值 (paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)采用Dixon的Up-Down方法[6]，分別于術前1 d、術后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d上午10：00測定大鼠PWMT。采用不同強度(0.4 g、0.6 g、1.0 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、10.0 g) Von Frey絲測定 PWMT。以2.0 g開始，刺激大鼠足外側區(qū)域，測試時纖維絲呈S狀停留約5 s，間隔30 s，測5次，若5次中3次出現快速縮足或舔爪行為，記為“X”，則選用相鄰刺激遞減纖維絲繼續(xù)操作；反之則記為“O”，選擇相鄰刺激遞增纖維絲繼續(xù)刺激，如此操作，出現第一個“X”后繼續(xù)測量5次，或者為5個字符的OOOOO和4個字符的XXXX，查表并利用公式換算得到PWMT。

5 GABAAα1受體表達水平檢測 建模后14 d檢測PWMT后，麻醉大鼠，打開胸腔，灌注沖洗后斷頭處死，參照大鼠腦立體定位圖譜(第6版)快速切取vLPAG，提取腦蛋白組織。BCA法測定總蛋白濃度，電泳分離并轉膜，牛奶封閉液室溫下封閉2 h，分別加兔抗大鼠GABAAα1一抗溶液(1∶1 000)和抗大鼠GAPDH(1∶2 000)，4℃環(huán)境中孵育過夜，TBST清洗后，加HRP標記的山羊抗兔二抗溶液(1∶3 000)室溫孵育2 h，再次TBST及TBS清洗后，使用天能5200發(fā)光檢測系統(tǒng)顯影并拍攝圖像，采用IPP6.0分析圖像，根據IOD值計算GABAAα1表達產物與GAPDH產物灰度比值，以此比值反映GABAAα1受體的相對表達水平。

6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，計量資料為多時點觀測計量資料，以±s表示，兩組比較行兩因素重復測量方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組大鼠PWMT變化 與C組大鼠各時相機械縮足反射閾值比較，S組大鼠無明顯改變；NP組大鼠術后第1天機械縮足反射閾值為0.907±0.251 g，明顯低于S組(8.216±1.428 g)，并在后期呈持續(xù)性降低(P＜0.05)。各組大鼠PWMT比較見圖1。

2 GABAAα1受體相對表達量變化 大鼠中腦導水管周圍灰質腹外側區(qū)處γ-氨基丁酸A受體α1受體蛋白表達水平為0.699±0.027，較C組(0.636±0.023)無明顯差異。NP組大鼠中腦導水管周圍灰質腹外側區(qū)處γ-氨基丁酸A受體α1受體蛋白相對表達量為1.442±0.015，明顯高于S組(0.699±0.027)(P＜0.05)。各組大鼠GABAAα1受體相對表達量的比較見圖2。

圖 1 各組大鼠PWMT變化(n=5)Fig.1 Changes of PWMT in rats in each group (n=5) ( aP＜0.05, vs group S; bP＜0.05, vs 0 d)

圖 2 各組大鼠GABAAα1受體表達量的變化(n=5)Fig. 2 Changes of GABAAα1 receptor expression in rats in each group (n=5) ( aP＜0.05, vs group S)

討 論

目前神經源性疼痛動物模型較多，包括慢性坐骨神經壓迫模型、脊神經結扎(spinal nerve ligation，SNL)模型以及SNI模型等[7]，其中SNI模型是NP的常用模型之一，其具有機械痛敏感、神經損傷程度可判斷、模型制作重復性高、產生行為學可維持6個月之久、最接近于臨床NP的特點[5]。本研究中，NP組大鼠術后出現手術足外翻畸形、自發(fā)性縮足舔爪等疼痛學行為，且機械痛閾持續(xù)下降，并維持整個觀察階段。這些特征都與Woolf建立的SNI模型一致。

以往關于GABAA受體在NP中作用的相關研究集中于脊髓水平，而在中腦水平方面的研究報道較少。據報道，PAG在SNL大鼠疼痛傳導過程中發(fā)揮重要作用[8]，是痛覺信號傳遞過程中一個承上啟下的重要結構，它既接受脊髓的痛覺傳入[9]，將其投射至丘腦核團，處理上行的痛覺反應，也可以通過延髓腹內側核投射通路下行調節(jié)痛覺反應。下行調節(jié)系統(tǒng)的關鍵位置即vLPAG和腦干嘴端腹內側髓質區(qū)[10]。在NP大鼠vLPAG放置可以刺激神經的電極進行深部腦刺激有不錯的鎮(zhèn)痛效果[11]。GABAA受體是一種主要存在于中樞神經系統(tǒng)的抑制性離子型受體，GABAA受體復合物的組裝及功能可能與GABAA受體α亞單位有關[12]，此外GABA能神經亞群參與中腦導水管周圍灰質的感受調節(jié)[13]。本研究組前期的研究表明，GABAA受體α亞單位可能參與急性疼痛在中腦導水管周圍灰質腹外側區(qū)的傳導過程[14]。這些研究可以幫助我們推測GABAAα1是否參與vLPAG對神經病理性疼痛傳導的調節(jié)機制。

本研究發(fā)現，大鼠SNI造模后機械痛閾降低，并持續(xù)整個觀察階段，Western blotting結果顯示，中腦導水管周圍灰質腹外側區(qū)GABAAα1蛋白相對表達量在造模后上調，這可能是GABAAα1受體參與中腦水平的疼痛調節(jié)機制所致。有研究發(fā)現CCI大鼠GABAAα2表達改變與脊髓疼痛傳導有關[15-16]，GABAAα1信使核糖核酸已被發(fā)現在硝酸甘油偏頭痛大鼠模型中發(fā)揮作用[17]；GABAAα5也被證明對NP形成有重要作用[18]，這些研究表明GABAA受體α亞單位在疼痛模型中發(fā)揮重要作用。但NP大鼠vLPAG GABAAα1受體的改變趨勢仍缺少研究支持，因此通過本研究可推測GABAAα1受體可能參與vLPAG對NP傳導的調節(jié)機制。

綜上所述，神經病理性疼痛大鼠中腦導水管周圍灰質腹外側區(qū)GABAAα1表達上調，可能參與vLPAG對神經病理性疼痛傳導的調節(jié)機制，但具體機制仍有待進一步研究。

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